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白酒是一类含有大量香味物质的饮料,在白酒风味的形成过程中,酯类物质发挥了重要的作用,怎样提高白酒中酯类的含量,是白酒生产者亟待解决的问题。然而,关于产酯酵母产酯机理的研究比较少,通过对低产乙酸乙酯突变株的DNA与出发菌株的DNA进行比对,在基因文库中寻找产酯关联基因,是进一步了解产酯机理的方法。本课题以产酯酵母BTL-Y01为出发菌株,经过复合诱变选育,获得低产乙酸乙酯突变株,并构建产酯酵母基因文库,为进一步探索产酯酵母产乙酸乙酯的代谢机理奠定理论基础。主要研究结果结果如下:
1、产酯酵母的诱变育种。对产酯酵母BTL-Y01进行液体培养,用比浊法测定生长曲线。根据产酯酵母生长曲线得知,该菌株培养8h进入对数生长期。通过致死曲线的制作,得到紫外诱变最佳剂量为100s,化学诱变剂DES最佳剂量为42min。通过紫外诱变得到一低产突变株Y12,对其培养后的发酵液进行气相色谱测定乙酸乙酯的含量,其产乙酸乙酯能力为0.091g/L,较出发菌株BTL-Y01的产乙酸乙酯能力降低了95.8%,再进行化学诱变筛选出低产乙酸乙酯的突变株YB8,该突变株产乙酸乙酯含量为0.013g/L。经遗传稳定性实验证明,YB8突变的遗传稳定较好。
2、产酯酵母DNA文库的构建。将产酯酵母BTL-Y01菌株与带有pPIC9质粒的大肠杆菌GHI菌株进行培养后,采用碱裂解法提取酵母基因组DNA和pPIC9质粒,利用限制性内切酶对BTL-Y01菌株的总基因组和pPIC9质粒经行单酶切,回收7~9kbp的酵母基因组DNA片段,与磷酸化的载体pPIC9进行连接,转化至大肠杆菌感受态细胞,构建DNA文库,经验证,文库大小为2.21×103pfu。
3、产酯酵母cDNA文库的构建。通过SMART(switch mechanism at5′end of mRNAtemplate)技术,利用帽子结构的特征,合成一段寡核苷酸作为CapSwitch,在oligo(dT)引导逆转录后作为PCR扩增5端的引物,合成全长cDNA,后经Trimmer-Direct进行均一化处理,处理后产物经Sfi酶切后与PGADT7-rec-AB载体连接,转化大肠杆菌DH10B。构建的cDNA文库的平均插入片段长度在1000b以上,空载率:0%,滴度:1.0×106cfu/ml,库容在3×106以上,cDNA文库的覆盖率达到74.07%,基本达到建库要求,可以利用此文库进行产酯酵母功能基因的筛选。
1、产酯酵母的诱变育种。对产酯酵母BTL-Y01进行液体培养,用比浊法测定生长曲线。根据产酯酵母生长曲线得知,该菌株培养8h进入对数生长期。通过致死曲线的制作,得到紫外诱变最佳剂量为100s,化学诱变剂DES最佳剂量为42min。通过紫外诱变得到一低产突变株Y12,对其培养后的发酵液进行气相色谱测定乙酸乙酯的含量,其产乙酸乙酯能力为0.091g/L,较出发菌株BTL-Y01的产乙酸乙酯能力降低了95.8%,再进行化学诱变筛选出低产乙酸乙酯的突变株YB8,该突变株产乙酸乙酯含量为0.013g/L。经遗传稳定性实验证明,YB8突变的遗传稳定较好。
2、产酯酵母DNA文库的构建。将产酯酵母BTL-Y01菌株与带有pPIC9质粒的大肠杆菌GHI菌株进行培养后,采用碱裂解法提取酵母基因组DNA和pPIC9质粒,利用限制性内切酶对BTL-Y01菌株的总基因组和pPIC9质粒经行单酶切,回收7~9kbp的酵母基因组DNA片段,与磷酸化的载体pPIC9进行连接,转化至大肠杆菌感受态细胞,构建DNA文库,经验证,文库大小为2.21×103pfu。
3、产酯酵母cDNA文库的构建。通过SMART(switch mechanism at5′end of mRNAtemplate)技术,利用帽子结构的特征,合成一段寡核苷酸作为CapSwitch,在oligo(dT)引导逆转录后作为PCR扩增5端的引物,合成全长cDNA,后经Trimmer-Direct进行均一化处理,处理后产物经Sfi酶切后与PGADT7-rec-AB载体连接,转化大肠杆菌DH10B。构建的cDNA文库的平均插入片段长度在1000b以上,空载率:0%,滴度:1.0×106cfu/ml,库容在3×106以上,cDNA文库的覆盖率达到74.07%,基本达到建库要求,可以利用此文库进行产酯酵母功能基因的筛选。