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背景与目的：
新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)可导致严重的长期残疾,包括脑瘫和脑损伤?小分子P7C3-A20已显示在多种疾病例如缺血性中风和神经退行性疾病中发挥神经保护作用?然而,尚不清楚P7C3-A20是否具有治疗HIE的潜力,并且P7C3-A20与神经元凋亡之间的关系尚不清楚?为了解决这些问题,本课题探究了P7C3-A20能否减轻PC12细胞氧糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation,OGD)模型以及出生后第7天和第14天的大鼠的缺氧缺血(Hypoxia-ischemia,HI)性脑损伤,以及其潜在的保护机制?
方法：
1.动物模型
（1）分组：选择生后7天的大鼠随机分为假手术组(Sham组n=15)、缺氧缺血组(HI组,n=15)、缺血缺氧+给药组(HI+P7C3-A20组,n=15)、(缺氧缺血+给药组+抑制剂组(HI+P7C3-A20+LY294002组,n=15)。
（2）缺氧缺血性脑损伤的模型建立：产后第7天的幼鼠用3%–4%异氟烷麻醉?为了防止血管再通,永久结扎了左颈总动脉?休息1小时后,将幼鼠置于玻璃室中,并暴露于由92%N2和8%O2组成的加湿气体混合物中缺氧2.5小时?玻璃室浸没在水浴中以保持温度在37℃?幼鼠缺氧后返回母鼠笼子?对照组进行假手术处理,仅做麻醉和割开皮肤,不结扎和缺氧?
（3）给药方法：将P7C3-A20(5mg/kg,10mg/kg)溶于二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中,最终浓度≤5%用于大鼠和≤1%用于细胞实验?造模结束后，给药组连续7天腹腔注射P7C3-A20，假手术组和缺氧缺血组腹腔注射同体积的无菌生理盐水，一天一次。其中，造模前30分钟，HI+P7C3-A20+LY组大鼠用脑立体定位仪注射抑制剂LY294002（50nmol/kg）。
2.细胞模型：
（1）分组：PC12细胞传代培养至60mm细胞培养皿中,然后随机分为对照组,氧糖剥夺组和氧糖剥夺+P7C3-A20组?在P7C3-A20联合治疗组中,在OGD之前2小时,分别加入10,20,40,60,80,100μM的P7C3-A20?
（2）OGD模型的建立：将分化的PC12细胞在95%空气/5%CO2的细胞培养箱中培养,并补充有10%FBS的DMEM?为了在体外模拟HIE的特征,将PC12细胞进行了氧糖剥夺处理?用无糖的DMEM代替正常完全培养基后,将细胞置于缺氧室(95%N2和5%CO2)中1?2?4?8?12?16和24小时?缺氧缺糖后,将细胞在正常DMEM中培养,并置于37℃的常氧(5%CO2)培养箱中24小时?对照组细胞仍在没有缺氧缺糖的环境中生长?
（3）给药：在缺氧缺糖处理前后都给予P7C3-A20?对于对照组和OGD组,仅使用PBS?
3.指标检测：
(1)TTC染色检测脑梗死面积?
(2)Western blot检测MAP-2,MBP,AKT,GSK-3β,BAX,BCL-2,caspase3的表达?
(3)免疫组化染色检测脑中MAP-2和MBP的表达?
(4)HE染色和尼氏染色观察新生鼠大脑皮层和海马的结构和细胞形态?
(5)CCK-8法检测PC12细胞的活力?
(6)采用TUNEL法观察凋亡神经元细胞?
(7)两种运动功能测试用于评估第28天大鼠药物治疗后同侧半球损伤和恢复情况?
4.统计分析
定量数据以平均值±SEM表示,并使用Prism v7.0软件进行分析?使用独立样本t检验评估组之间差异的显著性,并且认为差异在P＜0.05具有统计学意义?
结果：
1.TTC法检测新生大鼠的脑梗死面积
缺氧缺血24小时后,通过TTC染色检查脑梗塞区域?与HIE组相比,5mg/kg组和10mg/kg组P7C3-A20处理的大鼠的脑梗死面积减少?其中10mg/kg组减少的较5mg/kg更加明显?
2.CCK8法和Tunel法检测PC12细胞活性和细胞凋亡
CCK-8法被用于评估复氧后的细胞活力?研究发现OGD处理8小时,然后再复氧24小时,可降低细胞活力,而不会显著增加细胞凋亡率,能够保持50%左右的细胞存活率?在40–100μM P7C3-A20处理下,经受OGD处理的细胞的活力比其他组好?TUNEL法分析的结果表明,与OGD组相比,P7C3-A20治疗显著减少了细胞凋亡?
3.HE染色观察脑组织结构免疫组化法观察MAP-2和MBP表达情况
HE染色显示,P7C3-A20处理和未处理的大鼠在皮层组织损伤程度上存在显著差异?免疫组织化学分析显示,P7C3-A20减少了由缺氧缺血引起的MAP-2和MBP表达的下调?
4.Tunel染色和尼氏染色观察脑组织内神经元细胞情况
Tunel染色结果显示,HI后TUNEL阳性细胞数量增加,而P7C3-A20组阳性细胞增加较少?尼氏染色结果显示,新生大鼠缺氧缺血损伤导致大脑皮层?海马及纹状体区域细胞皱缩?细胞核固缩及尼氏小体缺如等变性,甚至死亡的神经元明显增加?P7C3-A20组的变性神经元明显减少?
5.HE染色观察心肝脾等器官未发现P7C3-A20对新生大鼠其他器官有毒性作用。
解剖心脏,肝,脾,肺和肾后通过HE染色进行组织形态学分析?我们发现,在高剂量的P7C3-A20和生理盐水组中,都没有任何纤维化或细胞以及组织结构异常。这表明P7C3-A20对新生大鼠其他器官没有明显的毒性作用。
6.Longa和Berderson测试评估新生大鼠的运动能力
行为学测试结果显示,HI组神经功能相较于Sham组显著下降(P＜0.001),而P7C3-A20可明显改善大鼠缺氧缺血损伤后的神经功能损伤(P＜0.001)?因此推断,P7C3-A20可以改善缺氧缺血后的神经功能损伤?
7.Western blot检测PI3K/AKT/GSK3β信号通路中涉及细胞凋亡的蛋白质的表达
Western blot结果显示,P7C3-A20组的p-AKT/AKT以及p-GSK-3β/GSK-3β的表达量较HI组增高,P7C3-A20组的Bcl-2/Bax比值增加?发现与假手术组相比,HI组中裂解的caspase-3的水平上调而P7C3-A20组又降低?与HI组相比,P7C3-A20处理上调了Mcl-1蛋白（一种线粒体中主要的GSK3-β底物,Bcl-2基因家族的成员）?PI3K抑制剂LY294002逆转了观察到的上述P7C3-A20组的蛋白质表达水平的趋势?
结论：
1.P7C3-A20能减少新生大鼠缺氧缺血性脑损伤脑梗死体积，减轻脑水肿，促进脑组织形态学恢复，改善预后。
2.P7C3-A20在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤和PC12细胞氧糖剥夺（OGD）模型中均能抑制凋亡，促进神经元的存活。
3.未发现P7C3-A20对新生大鼠其他器官有毒性作用。
4.P7C3-A20通过激活PI3K/AKT/GSK3β途径在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤发挥神经保护作用。
新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)可导致严重的长期残疾,包括脑瘫和脑损伤?小分子P7C3-A20已显示在多种疾病例如缺血性中风和神经退行性疾病中发挥神经保护作用?然而,尚不清楚P7C3-A20是否具有治疗HIE的潜力,并且P7C3-A20与神经元凋亡之间的关系尚不清楚?为了解决这些问题,本课题探究了P7C3-A20能否减轻PC12细胞氧糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation,OGD)模型以及出生后第7天和第14天的大鼠的缺氧缺血(Hypoxia-ischemia,HI)性脑损伤,以及其潜在的保护机制?
方法：
1.动物模型
（1）分组：选择生后7天的大鼠随机分为假手术组(Sham组n=15)、缺氧缺血组(HI组,n=15)、缺血缺氧+给药组(HI+P7C3-A20组,n=15)、(缺氧缺血+给药组+抑制剂组(HI+P7C3-A20+LY294002组,n=15)。
（2）缺氧缺血性脑损伤的模型建立：产后第7天的幼鼠用3%–4%异氟烷麻醉?为了防止血管再通,永久结扎了左颈总动脉?休息1小时后,将幼鼠置于玻璃室中,并暴露于由92%N2和8%O2组成的加湿气体混合物中缺氧2.5小时?玻璃室浸没在水浴中以保持温度在37℃?幼鼠缺氧后返回母鼠笼子?对照组进行假手术处理,仅做麻醉和割开皮肤,不结扎和缺氧?
（3）给药方法：将P7C3-A20(5mg/kg,10mg/kg)溶于二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中,最终浓度≤5%用于大鼠和≤1%用于细胞实验?造模结束后，给药组连续7天腹腔注射P7C3-A20，假手术组和缺氧缺血组腹腔注射同体积的无菌生理盐水，一天一次。其中，造模前30分钟，HI+P7C3-A20+LY组大鼠用脑立体定位仪注射抑制剂LY294002（50nmol/kg）。
2.细胞模型：
（1）分组：PC12细胞传代培养至60mm细胞培养皿中,然后随机分为对照组,氧糖剥夺组和氧糖剥夺+P7C3-A20组?在P7C3-A20联合治疗组中,在OGD之前2小时,分别加入10,20,40,60,80,100μM的P7C3-A20?
（2）OGD模型的建立：将分化的PC12细胞在95%空气/5%CO2的细胞培养箱中培养,并补充有10%FBS的DMEM?为了在体外模拟HIE的特征,将PC12细胞进行了氧糖剥夺处理?用无糖的DMEM代替正常完全培养基后,将细胞置于缺氧室(95%N2和5%CO2)中1?2?4?8?12?16和24小时?缺氧缺糖后,将细胞在正常DMEM中培养,并置于37℃的常氧(5%CO2)培养箱中24小时?对照组细胞仍在没有缺氧缺糖的环境中生长?
（3）给药：在缺氧缺糖处理前后都给予P7C3-A20?对于对照组和OGD组,仅使用PBS?
3.指标检测：
(1)TTC染色检测脑梗死面积?
(2)Western blot检测MAP-2,MBP,AKT,GSK-3β,BAX,BCL-2,caspase3的表达?
(3)免疫组化染色检测脑中MAP-2和MBP的表达?
(4)HE染色和尼氏染色观察新生鼠大脑皮层和海马的结构和细胞形态?
(5)CCK-8法检测PC12细胞的活力?
(6)采用TUNEL法观察凋亡神经元细胞?
(7)两种运动功能测试用于评估第28天大鼠药物治疗后同侧半球损伤和恢复情况?
4.统计分析
定量数据以平均值±SEM表示,并使用Prism v7.0软件进行分析?使用独立样本t检验评估组之间差异的显著性,并且认为差异在P＜0.05具有统计学意义?
结果：
1.TTC法检测新生大鼠的脑梗死面积
缺氧缺血24小时后,通过TTC染色检查脑梗塞区域?与HIE组相比,5mg/kg组和10mg/kg组P7C3-A20处理的大鼠的脑梗死面积减少?其中10mg/kg组减少的较5mg/kg更加明显?
2.CCK8法和Tunel法检测PC12细胞活性和细胞凋亡
CCK-8法被用于评估复氧后的细胞活力?研究发现OGD处理8小时,然后再复氧24小时,可降低细胞活力,而不会显著增加细胞凋亡率,能够保持50%左右的细胞存活率?在40–100μM P7C3-A20处理下,经受OGD处理的细胞的活力比其他组好?TUNEL法分析的结果表明,与OGD组相比,P7C3-A20治疗显著减少了细胞凋亡?
3.HE染色观察脑组织结构免疫组化法观察MAP-2和MBP表达情况
HE染色显示,P7C3-A20处理和未处理的大鼠在皮层组织损伤程度上存在显著差异?免疫组织化学分析显示,P7C3-A20减少了由缺氧缺血引起的MAP-2和MBP表达的下调?
4.Tunel染色和尼氏染色观察脑组织内神经元细胞情况
Tunel染色结果显示,HI后TUNEL阳性细胞数量增加,而P7C3-A20组阳性细胞增加较少?尼氏染色结果显示,新生大鼠缺氧缺血损伤导致大脑皮层?海马及纹状体区域细胞皱缩?细胞核固缩及尼氏小体缺如等变性,甚至死亡的神经元明显增加?P7C3-A20组的变性神经元明显减少?
5.HE染色观察心肝脾等器官未发现P7C3-A20对新生大鼠其他器官有毒性作用。
解剖心脏,肝,脾,肺和肾后通过HE染色进行组织形态学分析?我们发现,在高剂量的P7C3-A20和生理盐水组中,都没有任何纤维化或细胞以及组织结构异常。这表明P7C3-A20对新生大鼠其他器官没有明显的毒性作用。
6.Longa和Berderson测试评估新生大鼠的运动能力
行为学测试结果显示,HI组神经功能相较于Sham组显著下降(P＜0.001),而P7C3-A20可明显改善大鼠缺氧缺血损伤后的神经功能损伤(P＜0.001)?因此推断,P7C3-A20可以改善缺氧缺血后的神经功能损伤?
7.Western blot检测PI3K/AKT/GSK3β信号通路中涉及细胞凋亡的蛋白质的表达
Western blot结果显示,P7C3-A20组的p-AKT/AKT以及p-GSK-3β/GSK-3β的表达量较HI组增高,P7C3-A20组的Bcl-2/Bax比值增加?发现与假手术组相比,HI组中裂解的caspase-3的水平上调而P7C3-A20组又降低?与HI组相比,P7C3-A20处理上调了Mcl-1蛋白（一种线粒体中主要的GSK3-β底物,Bcl-2基因家族的成员）?PI3K抑制剂LY294002逆转了观察到的上述P7C3-A20组的蛋白质表达水平的趋势?
结论：
1.P7C3-A20能减少新生大鼠缺氧缺血性脑损伤脑梗死体积，减轻脑水肿，促进脑组织形态学恢复，改善预后。
2.P7C3-A20在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤和PC12细胞氧糖剥夺（OGD）模型中均能抑制凋亡，促进神经元的存活。
3.未发现P7C3-A20对新生大鼠其他器官有毒性作用。
4.P7C3-A20通过激活PI3K/AKT/GSK3β途径在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤发挥神经保护作用。