论文部分内容阅读
背景:高血压由于其高发病率以及伴随心血管和肾脏疾病的风险,已经成为世界范围内的重要的公共卫生挑战。在人类高血压中,蛋白尿是高血压肾脏损伤的主要征兆。长期高血压引起的蛋白尿与肾小球受损有关,主要是由于长期肾小球内渗透压过高引起的肾小球毛细血管滤过功能不全。肾小球毛细血管滤过屏障包括三层:足细胞,肾小球毛细血管内皮窗孔的系统和肾小球基底膜。众所周知,高血压影响足细胞的完整性,而且足细胞功能障碍在蛋白尿和肾小球硬化的发病机制中起重要作用。二甲双胍已被广泛用于治疗2型糖尿病,并且副作用极小。英国前瞻性糖尿病研究表明,二甲双胍可以降低大血管和微血管疾病的发病率,其中的可能机制包括减少胰岛素抵抗和炎性细胞浸润、改善血管内皮功能和纤溶系统、影响碳水化合物和脂质代谢以及其存在的抗动脉粥样硬化和抗炎作用。另外,二甲双胍还可以通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号对糖尿病引起的肾损伤具有保护作用,并且显著降低了2型糖尿病患者的尿白蛋白排泄率。然而,二甲双胍保护肾脏的确切机制仍不清楚。因此,我们研究了二甲双胍对蛋白尿的影响,并探索在自发性高血压大鼠模型的机制。血管内皮生长因子(VEGF)是一种促血管生成因子,持续高表达于肾脏中,在构建和维持肾小球毛细血管滤过屏障中起重要作用。凡德他尼是VEGF受体抑制剂。因此,我们主要探讨二甲双胍对大鼠肾脏VEGF分泌与蛋白尿的关系以及VEGF受体阻滞剂对于经过二甲双胍治疗的48周龄自发性高血压大鼠(SHR)蛋白尿的影响。目的:1、长期二甲双胍治疗能否减少自发性高血压大鼠的蛋白尿以及保护肾功能;2、研究二甲双胍降低蛋白尿的作用分子机制;方法:总共59只8周龄的雄性大鼠用于本研究。其中32只为自发性高血压大鼠(SHR),27只为Wistar-Kyoto大鼠(WKY)。22只SHR大鼠和19只WKY大鼠以100mg/kg/天的剂量接受二甲双胍灌胃治疗(SHR-Met组和WKY-Met组)。二甲双胍溶于饮用水中。其余10只SHR大鼠和8只WKY大鼠单独接受饮用水,作为对照组(SHR-Vehicle组和WKY-Vehicle组)。所有动物每天进行检查并每周称重一次。治疗期为10个月。定期测量动物清晨空腹血糖。在测量空腹血糖之前,将动物笼中的食物移除12小时。在尾静脉末端收集血样。采用尾套法测量SBP,使动物处于安静的环境。平均SBP读数是在10分钟内从至少三次连续记录中获得的。为了测量尿蛋白,将大鼠单独饲养于代谢笼中24小时,给予自由饮水和标准饮食,避免尿液污染,收集24小时尿液。在每组数据收集之前,没有鼠死亡。实验后期,分别随机取10只经过二甲双胍治疗的48周龄WKY大鼠和SHR大鼠,其中5只WKY大鼠和5只SHR大鼠以12.5mg/kg/天的剂量接受凡德他尼灌胃治疗(WKY-vandetanib组和SHR-vandetanib组)。凡德他尼溶解于山梨聚糖80中。其余5只SHR大鼠和5只WKY大鼠单独接受山梨聚糖80灌胃治疗,作为对照组(SHR-Vehicle组和WKY-Vehicle组)。治疗期为2周。为了测量尿蛋白,将大鼠单独饲养于代谢笼中24小时,给予自由饮水和标准饮食,避免尿液污染,收集24小时尿液。在数据收集之前,没有鼠死亡。剩下的大鼠,将其麻醉,取肾脏组织用于组织学和电镜分析,以及收集腹主动脉血液,离心之后收集上清,测量血清肌酐和血尿素氮。1、收集动物24小时尿液,测量尿蛋白;2、病理学分析:将大鼠的肾脏用于HE染色,观察各组大鼠肾组织病理改变;3、免疫组化分析:应用免疫组化学观察VEGF-A的表达量;4、透射电镜分析:应用透射电镜观察肾小球滤过屏障的微观变化;5、酶联免疫吸附测定:应用酶联免疫吸附测定肾脏组织中VEGF-A表达量;6、Western blot:应用western blot观察p-AMPK,AMPK-α,VEGF-A的表达量。结果:1、体重、血压、血清肌酐、血尿素氮、清晨空腹血糖以及血清胰岛素水平:实验最终阶段各组之间大鼠体重、血清尿素氮以及清晨空腹血糖无统计学差异。但是,经过二甲双胍治疗的大鼠血肌酐下降。SHR大鼠的血压高于对照组WKY大鼠,SHR-Met大鼠与SHR大鼠的血压无统计学差异。SHR组大鼠的血清胰岛素高于对照组WKY大鼠(P<0.01)。经过二甲双胍治疗后SHR大鼠的血清胰岛素下降(P<0.01)。2、大鼠24小时尿蛋白:SHR大鼠的尿蛋白高于对照组WKY大鼠(P<0.01)。经过二甲双胍治疗之后,SHR大鼠的尿蛋白降低(P<0.01)。经vandetanib治疗之后,48周龄经过二甲双胍治疗后的SHR大鼠蛋白尿显着增加(P<0.01)。3、病理学分析:HE染色显示SHR大鼠的肾小管间隙炎性细胞(中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)浸润增多。定量计数炎性相关细胞切片中提示,SHR大鼠当中的炎性细胞比对照组WKY大鼠明显增多,经过二甲双胍治疗的SHR大鼠中的炎性细胞明显减少(P<0.01)。4、免疫组化学分析:经过二甲双胍治疗的大鼠肾脏VEGF-A表达量增加。5、透射电镜分析:SHR大鼠的内皮细胞窗孔明显减少,经过二甲双胍治疗的SHR以及WKY大鼠的内皮细胞窗孔明显存在。SHR大鼠有广泛的足细胞足突融合,但是经过二甲双胍治疗的SHR大鼠只有偶见的足突融合。6、酶联免疫吸附测定:经过二甲双胍治疗的大鼠肾脏VEGF表达量增多。7、Western blot:Western blot显示经过二甲双胍治疗的大鼠肾脏p-AMPK和VEGF-A表达量增多,AMPK-α表达量各组间无差异。结论:二甲双胍减少自发性高血压大鼠的蛋白尿并且具有保护肾脏的作用,其中可能与肾脏VEGF表达上调的参与有关。