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第一部分帕金森病基因多态性研究第一节GAPDH基因多态性与PD关联分析目的:采用病例对照研究,对PD患者与正常对照组中GAPDH基因进行遗传学分析,并探讨GAPDH基因与PD发病风险及相关性。方法:收集265例原发性PD患者和性别、年龄匹配的269例正常人外周血,采用外周血DNA提取试剂盒,提取基因组DNA。采用SNaPshot的方法检测目的基因并分析结果。结果:所测GAPDH基因中其5’非编码区点rs1136666基因多态性,与PD发病相关。其中G为保护碱基,且此点男性病例对照研究统计学有明显差异性,而女性研究无统计学意义。此点在早发组病例对照研究中等位基因频率研究有统计学意义,但基因型研究无统计学意义。在晚发组等位基因频率研究及基因型研究均有统计学意义。结论:GAPDH基因5’非编码区点rs1136666多态性与PD发病相关,且其相关性与性别、年龄有关。男性、老龄是该基因与PD相关发病的危险因素。第二节NCAPD2、GAPDH家族、PKP2P1、PPM1H、CD9、ETV6基因多态性与PD相关性分析目的:采用病例对照研究,对PD患者与正常对照组中基因组其他入组基因进行遗传学分析,并探讨这些基因与PD发病风险及相关性。方法:收集265例原发性PD患者和性别、年龄匹配的269例正常人外周血,采用外周血DNA提取试剂盒,提取基因组DNA。采用SNaPshot的方法检测目的基因并分析结果。结果:GAPDH基因上游NCAPD2基因中rs7311174、rs2072374位点基因多态性在PD病例对照研究中有统计学意义,而rs740850位点基因多态性在PD病例对照研究中无统计学意义。GAPDH家族位点中rs2029721、s4806173、rs12984928基因多态性在PD病例对照研究中没有统计学意义。rs10492243在此次研究中与PD有强烈的关联性。rs2008134、rs342169、rs740839、rs732868在此次病例对照研究中没有统计学意义。结论:NCAPD2基因与PD发病相关。GAPDH家族中位点所纳入此次研究的三个点未发现与PD相关联。第二部分GAPDH基因突变与PD关系研究第一节鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞的氧化水平研究目的:观察鱼藤酮干预SH-SY5Y细胞后细胞内氧化水平的变化。方法:进行SH-SY5Y细胞培养。将细胞按浓度梯度分组,MTT法摸索最佳干预浓度。光镜下观察各浓度梯度细胞形态学变化。使用DCFH-DA处理细胞后流式细胞仪观察细胞内氧化水平变化;采用SOD Assay kit检测细胞内SOD活性水平;采用TBARS Assay kit检测细胞内脂质过氧化水平。结果:MTT检测细胞活力摸索出细胞最适干预浓度为500nnM,且细胞活力与干预浓度呈浓度依赖性。光镜下观察细胞发现经不同浓度处理的细胞,200nM少量细胞出现形态学改变,随着浓度的改变,细胞形态学及细胞数量减少的更为明显,2μM的鱼藤酮加入培养基后细胞几乎停止生长,突起消失变圆。使用DCFH-DA处理500nnM鱼藤酮处理后的细胞发现细胞内ROS水平升高;SOD Assay kit检测细胞内SOD活性水平降低;采用TBARS Assay kit检测细胞内脂质过氧化增强。结论:鱼藤酮干预细胞后能使细胞内氧化水平升高,SOD水平降低,脂质过氧化增强。第二节GAPDH基因5,非编码区突变对细胞功能的影响目的:构建rs1136666点突变载体,探讨GAPDH基因突变与PD的关系。方法:进行SH-SY5Y细胞培养,克隆点rs1136666点所在片段。根据分组采用鱼滕鲖或载体单个或同时进行干预细胞。摸索载体转染细胞的合适浓度及转染时间以及检验时间。使用实时荧光定量PCR观察各组中GAPDH基因表达情况。使用western blot观察各组细胞中GAPDH表达的情况及观察各组中凋亡的情况。使用SOD Assay kit检测细胞内SOD活性水平;采用TBARS Assay kit检测细胞内脂质过氧化水平。使用流式细胞仪对各组细胞中神经元凋亡进行检测,比较各组细胞经干预后细胞凋亡的情况;使用DCFH-DA处理细胞后在流式细胞仪中检测,对各组细胞中神经元中氧化应激水平作出比较。结果:实时荧光定量PCR示GAPDH基因5’非编码区突变引起细胞内mRNA表达降低;western blot示GAPDH基因5’非编码区突变可引起细胞内凋亡蛋白表达增高,抗凋亡蛋白表达降低,GAPDH表达增高。而GAPDH突变转染与rot联用可增强凋亡作用。流式细胞仪中观察到GAPDH突变转染后的细胞凋亡增加,加用鱼藤酮后,凋亡作用更强。DCFH-DA处理后的细胞可见GAPDH突变转染的细胞中ROS水平增高,鱼藤酮可增强这一作用。GAPDH基因5’非编码区突变转染后的细胞内SOD水平下降,GAPDH基因5’非编码区突变转染后细胞内脂质过氧化水平增高,而鱼藤酮使SOD水平下降及脂质过氧化增高得更明显。结论:GAPDH基因5’非编码区突变,可引起mRNA表达异常,蛋白折叠障碍,异常GAPDH聚集,最终引起细胞死亡,加入鱼藤酮后,细胞内凋亡各项指标发生改变。第三节GAPDH过表达对细胞功能的影响目的:构建GAPDH过表达载体,探讨GAPDH基因过表达与PD的关系。GAPDH基因过表达与GAPDH突变共同在PD中的关系研究。方法:进行SH-SY5Y细胞培养,构建GAPDH过表达载体。根据分组采用鱼滕鲖或载体单个或同时进行干预细胞。摸索载体转染细胞的合适浓度及转染时间以及检验时间。使用DCFH-DA处理细胞后在流式细胞仪中检测,对各组细胞中神经元中氧化应激水平作出比较。用SOD Assay kit检测细胞内SOD活性水平;采用TBARS Assay kit检测细胞内脂质过氧化水平。使用western blot观察各组细胞中GAPDH表达的情况及观察各组中凋亡情况。使用流式细胞仪对各组细胞中神经元凋亡进行检测,比较各组细胞经干预后细胞凋亡的情况。使用非变性PAGE胶印迹GAPDH基因5’非编码区突变及GAPDH过表达以及鱼藤酮处理细胞后细胞内GAPDH多聚体表达情况。结果:western blot示过表达载体转染的细胞内GAPDH表达增高,流式细胞仪观察细胞凋亡增多。DCFH-DA示过表达载体转染后的细胞中ROS水平增高。而当GAPDH突变与过表达同时存在时这一作用被增强。非变性PAGE胶印迹示GAPDH基因5’非编码区突变及GAPDH过表达以及鱼藤酮处理细胞后细胞内异常GAPDH表达增多。结论:GAPDH过表达时细胞内氧化水平增高,促进细胞凋亡,当过表达与突变同时存在时,细胞凋亡作用更强。