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[目的]三七皂苷R1是五加科多年生草本植物三七的特征性成分。前期研究显示三七皂苷R1可诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡,具体作用机制不清[1]。本文通过不同浓度(20μg/ml-200μg/ml 三七皂苷R1对体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞进行干预,观察三七皂苷R1对体外瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响,筛选最佳浓度为 120μg/ml,作用 48 小时后,观察 Wnt5a、β-catenin、GSK-3β、β-GSK-3β蛋白及mRNA水平的变化。探讨三七皂苷R1诱导人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的分子机制及Wnt/β-catenin信号转导通路的作用,为临床防治瘢痕疙瘩提供分子及病理学水平的理论依据。[方法]收集人瘢痕疙瘩组织(keloid,K)及正常皮肤组织(nomal skin,NS),应用组织块法分离原代培养成纤维细胞(fibroblastcell,FC),进行成纤维细胞鉴定及绘制生长曲线,用不同浓度(20μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、150μg/ml、160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml)的三七皂苷R1干预体外瘢痕疙瘩成纤维细胞,水溶性四唑盐-WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4_二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)(Cell Counting Kit-8,CCK-8)法进行细胞增殖-毒性检测,筛选出最佳药物浓度为120μg/ml,此浓度作为以下实验的浓度。通过Western Blot和RT-PCR法对三七皂苷R1干预后成纤维细胞Wnt/β-catenin信号转导通路中相关信号分子Wnt5a、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β进行蛋白和mRNA水平定性及半定量研究。[结果]1.体外培养瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞形态学研究应用组织块法分离原代培养成纤维细胞,在倒置显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化,在接种后第5-7天可见瘢痕疙瘩组织块边缘有梭型细胞爬出,而正常细胞则8-10天后才有细胞爬出。成纤维细胞形态呈梭形或者不规则三角形,两种细胞形态无明显差异,生长排列多呈放射状、编织状、漩涡状走行。瘢痕疙瘩成纤维细胞排列紊乱,极性消失,有明显交叉重叠现象,而正常细胞排列规律,呈平行极性。2.成纤维细胞鉴定采用成纤维细胞波形蛋白免疫细胞化学染色,成纤维细胞胞浆内见大量棕黄色颗粒,所培养细胞为成纤维细胞。3.CCK-8检测初筛时,瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast cell,KFC)经浓度分别为(20μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、150μg/ml、160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml)的三七皂苷 R1 作用 48h 后,0D 值为分别为 20μg/ml(3.0391±0.061277)、40μg/ml(2.792133±0.154944)、50μg/ml(2.923967±0.124839)、60μg/ml(2.626233±0.120606)、70μg/ml(2.833133±0.07763 8)、80μg/ml(2.518467±0.02166)、90μg/ml(2.8656±0.0603 83)、100μg/ml(2.510367±0.093041)、110μg/ml(2.477233±0.062628)、120μg/ml(2.376833±0.062446)、130μg/ml(2.650733±0.030904)、140μg/ml(2.704233±0.103737)、150μg/ml(2.411533±0.087351)、160μg/ml(2.587567±0.083547)、170μg/ml(2.3122±0.047022)、180μg/ml(2.604867±0.106829)、190μg/ml(2.2339±0.02324)、200μg/ml(2.492±0.047627)与对照组相比0μg/ml(2.540933±0.005033),药物浓度在110-180μg/ml之间存在数个点OD值较对照组明显降低(P<0.05),成纤维细胞的增殖受到明显抑制,故细筛时将药物浓度范围缩小至110-180μg/ml,经以下浓度(110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、150μg/ml、160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml)的三七皂苷R1 作用 48h 后,OD 值为分别为 110μg/ml(2.813825±0.019997)、120μg/ml(2.768225±0.013087)、130μg/ml(3.006433±0.004104)、140μg/ml(2.879067±0.016539)、150μg/ml(2.78505±0.020184)、160μg/ml(2.750667±0.037108)与对照组相比 0μg/ml(2.953633±0.032493)明显降低(P<0.05),在170μg/ml-180μg/ml药物浓度范围时,镜下观察成纤维细胞已经片状死亡,在110μg/ml-160μg/ml药物浓度范围时,在120μg/ml时成纤维细胞的增殖受到最大抑制,故选取120μg/ml作为最佳药物作用浓度,为后续实验药物浓度。4.Western Blot 瘢痕疙瘩对照组蛋白 Wnt5a(4.054±0.0598)、β-catenin(0.3503±0.005484)、p-GSK-3 β(1.103±0.01276)与正常皮肤对照组蛋白 Wnt5a(0.3588±0.4688)、β-catenin(0.1509±0.003138)、p-GSK-3 β(0.5878±0.009849)相比,表达增高(P<0.05),瘢痕疙瘩对照组蛋白GSK-3β(0.3440±0.0055697)与正常皮肤对照组蛋白GSK-3β(0.3359±0.0040407)相比,表达无显著性差异。经120μg/ml三七皂苷R1处理后,瘢痕疙瘩实验组蛋白Wnt5a(3.029±0.06232)、β-catenin(0.225±0.005092)、p-GSK-3β(0.7634±0.006712)与正常皮肤实验组 Wnt5a(0.503436±0.005947)、β-catenin(0.1489±0.0029203)、p-GSK-3β(0.618845±0.00444019)相比,表达增高(P<0.05),瘢痕疙瘩实验组蛋白GSK-3β(0.3558±0.0056497)与正常皮肤实验组蛋白 GSK-3β(0.301365±0.0017849)相比,表达无显著性差异。瘢痕疙瘩实验组蛋白Wnt5a(3.029±0.06232)、β-catenin(0.225±0.005092)、p-GSK-3 β(0.7634±0.006712)与瘢痕疙瘩对照组蛋白 Wnt5a(4.054±0.0598)、β-catenin(0.3503:±0.005484)、p-GSK-3 β(1.103±0.01276)相比表达降低(P<0.05),瘢痕疙瘩实验组蛋白GSK-3β(0.3558±0.0056497)与对照组GSK-3β(0.3440±0.0055697)相比,表达无显著性差异。5.RT-PCR 瘢痕疙瘩对照组 mRNA Wnt5a(45.3±0.82)、β-catenin(15.97±0.202)与正常皮肤对照组 mRNAWnt5a(1±0.18)、β-catenin(1±0.08)相比,表达增高(P<0.05),瘢痕疙瘩对照组mRNAGSK-3 β(1.126±0.22)与正常皮肤对照组mRNAGSK-3β(1±0.199)相比,表达无明显变化。经120μg/ml三七皂苷R1处理后,瘢痕疙瘩实验组mRNA Wnt5a(14.07±0.59)、β-catenin(1.487±0.087)与正常皮肤实验组 mRNA Wnt5a(1.211±0.16)、β-catenin(0.747±0.429)相比表达增高(P<0.05),瘢痕疙瘩实验组mRNA GSK-3β(1.555±0.24)与正常皮肤实验组mRNAGSK-3β(1.539±0.24)相比,表达无明显变化。瘢痕疙瘩实验组 mRNAWnt5a(14.07±0.59)、β-catenin(1.487±0.087)与瘢痕疙瘩对照组 mRNA Wnt5a(45.3±0.82)、β-catenin(15.97±0.202)相比表达降低(P<0.05),瘢痕疙瘩实验组mRNAGSK-3 β(1.555±0.24)与对照组mRNA GSK-3β(1.126±0.22)相比,表达无明显变化。6.RNA及DNA琼脂糖凝胶电泳正常皮肤对照组、正常皮肤实验组、正常皮肤DMSO组及瘢痕疙瘩对照组、瘢痕疙瘩实验组、瘢痕疙瘩DMSO组的RNA及 Wnt5a、β-catenin、GSK-3β、β-ActinDNA均显示出单一条带。[结论]1.GSK-3β磷酸化可能通过对成纤维细胞凋亡的抑制而在瘢痕疙瘩的形成中发挥作用,三七皂苷R1可能通过对抗p-GSK-3 β的作用而增加成纤维细胞凋亡;2.Wnt/β-catenin信号转导通路参与瘢痕疙瘩的形成:三七皂苷R1对成纤维细胞凋亡的影响可能藉由抑制Wnt/β-catenin信号转导通路活化而实现;3.三七皂苷R1通过调节Wnt/β-catenin信号转导通路及GSK-3β而具有抗纤维化作用,有望作为瘢痕疙瘩治疗的有效药物进一步研究开发;4.GSK-3β与Wnt/β-catenin信号转导通路在瘢痕疙瘩中复杂的相互关系值得关注,GSK-3β以及Wnt/β-catenin信号转导通路有望作为瘢痕疙瘩的治疗靶点进行深入研究。