目的随着我国生活水平的日益提高及步入老龄化社会,急性冠状动脉综合征(Acute Coronary Syndrome, ACS)的发生率逐步上升,而动脉粥样硬化斑块破裂是导致该病的重要原因。易于发生破裂的斑块可称为易损性斑块或不稳定性斑块,其特征为大的坏死核心和薄的纤维帽。临床研究发现斑块内炎症是引起斑块易损的关键因素,斑块破裂几乎总是与炎症共存,免疫细胞在其中发挥重要作用,其中CD4+T细胞在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用引起了广泛重视。己知CD4+T细胞受抗原刺激后在不同的细胞因子作用下可以分化为不同的亚群,包括传统的Thl细胞,Th2细胞和近年发现的两个新的亚群：Th17细胞和调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)。目前,不同CD4+T细胞亚群在动脉粥样硬化易损斑块中的作用尚不明确。为了探讨不同CD4+T细胞亚群与动脉斑块易损性的关系,我们首先利用ApoE-/-小鼠建立了动脉粥样硬化斑块破裂模型,然后分析了斑块破裂诱导前后CD4+T细胞亚群的改变,并根据获得的结果重点分析了Th17亚群及其效应分子IL-17与动脉斑块易损性的关系。研究结果对弄清动脉粥样硬化斑块易损性和斑块破裂的免疫机制、制定防治动脉粥样硬化斑块破裂的方案具有重要的理论价值和潜在的应用价值。本课题包括两部分内容：一、不同CD4+T细胞亚群对动脉粥样硬化斑块易损性和斑块破裂的影响：二、IL-17对动脉粥样硬化斑块易损性和斑块破裂的作用及机制研究。第一部分不同CD4+T细胞亚群对动脉粥样硬化斑块易损性和斑块破裂的影响方法一、动脉粥样硬化斑块破裂小鼠模型的建立1.动物及处理方案：75只8周龄的雄性ApoE-/-小鼠实验全程高脂饮食(含0.25%胆固醇和15%脂肪)喂养。实验动物随机分为5组：脂多糖组,应激组,脂多糖+应激组,脂多糖+应激+苯肾上腺素组和对照组。于10周行左侧颈总动脉套管(缩窄性硅胶管)术以诱发动脉粥样硬化。分别于术后6周(25只)或术后14周(50只)给予各组不同刺激。脂多糖组于刺激第一、二天给予脂多糖腹腔注射(1mg/kg);应激组于刺激第一、二天给予冰水刺激(每天5-10分钟)：脂多糖+应激组于刺激第一、二天联合给予应激和脂多糖刺激；脂多糖+应激+苯肾上腺素组于刺激第一、二天联合给予应激和脂多糖刺激,于刺激第三天给予苯肾上腺素腹腔注射(8μg/kg);对照组只给予生理盐水。共刺激三天,于刺激第四天处理。2.超声影像学检测动脉粥样硬化斑块破裂。3.病理学检测动脉粥样硬化斑块破裂：左侧颈动脉斑块制备连续石蜡及冰冻切片,苏木素-伊红染色、Masson三染、油红O染色以及免疫组织化学染色观察日噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)的局部表达。测量斑块面积、血管面积和纤维帽厚度；测量胶原、脂质、平滑肌细胞、巨噬细胞免疫组化阳性染色面积,并计算它们占斑块面积的比例。统计斑块的破裂率,计算易损指数。易损指数=(巨噬细胞+脂质)面积阳性百分比/(平滑肌细胞+胶原)面积阳性百分比。二、动脉粥样硬化斑块破裂诱导前后不同Th亚群的变化1.分别取同周龄动脉粥样硬化稳定性斑块和动脉粥样硬化破裂斑块小鼠的脾脏制备脾细胞悬液,进行多种标记。2.流式细胞术检测小鼠脾脏中Th1,Th17和Treg细胞的比例变化。三、动脉粥样硬化斑块破裂诱导前后相关转录因子的变化。取稳定斑块和破裂斑块小鼠的主动脉弓RT-PCR检测小鼠动脉粥样硬化斑块局部转录因子(T-bet、RORγyt)的表达情况。四、动脉粥样硬化斑块破裂诱导前血清细胞因子的变化取稳定斑块和破裂斑块小鼠血清,采用ELISA检测动脉粥样硬化斑块破裂诱导前后炎性因子变化(IL-17)结果一、动脉粥样硬化斑块破裂小鼠模型的建立由于目前国际上尚无理想的斑块破裂的小鼠模型,为了研究不同T细胞亚群在动脉粥样硬化易损中的作用,我们在参考已有研究的基础上,改进了建模方法,建立了一种动脉粥样硬化斑块破裂小鼠模型。(一)动脉粥样硬化易损性斑块的诱导我们选用8周龄ApoE敲基因小鼠,高脂饲料喂养两周后于小鼠左颈总动脉处套管,人工模拟血管狭窄,套管后继续高脂饲料喂养小鼠6周或14周诱导斑块的形成。处死小鼠后,取左颈总动脉制备切片,HE染色观察斑块大小,油红O染色观察脂质沉积,Masson三染观察胶原成分以及免疫组化检测巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌细胞(α-SM-actin)在局部的表达。结果发现动脉套管后14周与动脉套管后6周相比较,斑块面积明显增大(P<0.01),脂质成分增多,坏死核增大(P<0.05),纤维帽厚度明显变薄(P<0.05),平滑肌细胞减少,胶原含量减少,帽／核比值降低(P<0.01)。由此可见,随着周龄增长,动脉套管后14周小鼠斑块比动脉套管后6周小鼠斑块更趋近于不稳定,提示更易于发生斑块破裂。(二)动脉粥样硬化斑块破裂的诱导小鼠行颈动脉套管6周或14周末随机分成5组：对照组、LPS组,冰水刺激组,LPS+冰水刺激组和LPS+冰水刺激+苯肾上腺素组,分别给予不同的刺激诱导斑块的破裂,刺激过程中观察小鼠的基本体征,刺激三天后,处死小鼠,分析体重、脂质代谢及斑块破裂情况。1.不同刺激对小鼠的基本特征和脂质代谢的影响单独或联合刺激对脂质代谢参数(血总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白)均无明显影响；然而,LPS+冰水刺激或LPS+冰水刺激+苯肾上腺素处理的小鼠(动脉套管后6周和动脉套管后14周),出现精神不振,少动,进食减少,体重较对照组有所下降,但实验过程中均无小鼠死亡,可见联合刺激后小鼠的生理变化与ACS患者的临床表现相似。2.不同刺激对动脉粥样硬化斑块破裂的诱导动脉套管后6周LPS+冰水刺激组20%出现斑块内出血,LPS+冰水刺激组+苯肾上腺素组有60%出现斑块内出血,其他组未见斑块内明显变化。动脉套管后14周小鼠对照组和刺激组均有10-20%的小鼠颈动脉有埋入式斑块,提示有陈旧性斑块破裂的迹象。LPS+冰水刺激+苯肾上腺素组有20%出现斑块破裂伴血栓形成,40%出现斑块破裂伴出血,10%出现斑块破裂伴脂核膨出。排除埋入式斑块,斑块破裂率为70%。LPS+冰水刺激组出现10%斑块破裂伴出血,但未发现血栓形成,其他组未发现明显变化。这些结果指出动脉套管后14周小鼠经LPS+冰水+苯肾上腺素联合刺激,斑块破裂率高达70%,而相同刺激,在动脉套管后6周小鼠,仅有60%出现斑块内出血,未出现斑块纤维帽断裂或血栓形成的情况。动脉套管后14周小鼠的斑块较动脉套管后6周小鼠斑块更具易损斑块的特点,说明斑块破裂除了外源性刺激的触发作用外,斑块自身的易损性也是极为关键的因素之一。总之,我们在高脂喂养的基础上,利用ApoE-/-小鼠的颈动脉套置缩窄性套管的方法,诱发动脉粥样硬化易损斑块形成,再通过LPS、冰水刺激和苯肾上腺素联合刺激的方法在短时间内有效促发斑块破裂,且伴发血栓形成,相似于人类病变,建立了一种高效的动脉粥样硬化斑块破裂小鼠模型,为我们进一步研究动脉粥样硬化斑块破裂的免疫学机制提供了重要的动物模型。二、不同CD4+T细胞亚群与斑块破裂的关系上述研究说明LPS、冰水刺激和苯肾上腺素联合刺激,在套管后6周小鼠主要引起斑块内出血,在套管后14周小鼠可有效促发斑块破裂。故我们分别将套管后6周和14周小鼠分成两组：对照组(给予生理盐水处理)和干预组(LPS、冰水和苯肾上腺素联合刺激),然后用流式细胞术检测的不同CD4+亚群的改变,分析了他们与斑块破裂的关系。1.调节性T细胞(Tregs)与斑块破裂的关系已知调节性T细胞具有抑制动脉粥样硬化斑块形成的作用,但在斑块破裂中的作用尚不清楚。为了研究调节性T细胞与动脉粥样硬化斑块破裂的关系,我们采用流式细胞术的检测方法,分别检测了套管后6周、14周小鼠,对照组和干预组脾细胞中Tregs的变化。流式细胞术的检测结果发现动脉套管后6周干预组小鼠CD4+Foxp3+CD25+T细胞亚群与对照组小鼠比较明显降低,然而动脉套管后14周干预组小鼠CD4+Foxp3+CD25+T细胞亚群明显高于对照组(p<0.05),另外,我们发现除CD4+Foxp3+CD25++T细胞外,在ApoE-/-小鼠的脾脏尚有一群CD4+Foxp3+CD25-T细胞,这群细胞无论在动脉套管后6周或动脉套管后14周的干预组均明显高于对照组(P<0.05),说明这两群调节性T细胞亚群在动脉粥样硬化斑块破裂的过程中可能扮演着不同的角色。2.Thl细细胞与斑块破裂的关系已知Thl具有促进斑块形成、增加斑块易损性的作用。为了研究Thl细胞与动脉粥样硬化斑块破裂的关系,我们采用流式细胞术检测了外周Th1细胞的变化。我们发现在仅有斑块内出血时(动脉套管后6周)小鼠脾细胞中Thl(CD4+IFN-γ+T)细胞的数量在干预组与对照组间无明显差异；然而,在有明显斑块破裂时(动脉套管后14周)小鼠脾细胞中Thl(CD4+IFN-γ+T)细胞的数量较对照组明显升高,P<0.05。这一结果提示在本实验的模型中Th1细胞在斑块破裂中发挥一定的作用。3.Th17细胞与斑块破裂的关系近两年,我们和其他学者的研究显示Th17具有促进斑块形成的作用,但在斑块破裂中的作用尚不清楚。因此,我们在检测Th1变化的同时,采用流式细胞术检测了脾脏中Th17细胞的改变,流式细胞术检测结果显示我们发现在仅有斑块内出血时(动脉套管后6周)小鼠脾细胞中Th17(CD4+IL-17+T)细胞的数量在干预组明显高于对照组(P<0.05夕；在有明显斑块破裂时(动脉套管后14周)这种差异更加明显(P<0.001),提示我们Th17细胞与动脉粥样斑块易损性和斑块破裂密切相关。4.IL-17+IFN-γ+CD4+T细胞与斑块破裂的关系除了Th1(CD4+IFN-γ+T)和Th17(CD4+IL-17+T),我们还发现了一群共表达IL-17和IFN-γ的CD4+T细胞亚群(CD4+IL-17+IFN-γ+T)。统计结果发现动脉套管后6周和动脉套管后14周干预组均明显高于对照组,P<0.01。提示我们CD4+IL-17+IFN-γ+T细胞在小鼠动脉粥样硬化斑块易损性和斑块破裂中起着一定的促进作用。5.Th1+Th17/Treg、Th1/Treg和Th17/Treg和比例与斑块破裂的关系已知CD4+CD25+Foxp3+(?)调节性T细胞具有抑制动脉粥样硬化斑块形成的作用,Thl和Th17这些效应细胞主要是促进动脉粥样硬化斑块的形成,他们的平衡有可能决定斑块的稳定性,所以我们进一步分析了Th1+Th17/Treg、Th1/Treg和Th17/Treg比例与斑块破裂的关系,试图寻找在斑块破裂中起关键作用的T细胞亚群。我们发现Th1+Th17/Treg的比例在动脉套管后6周和动脉套管后14周干预组均高于对照组,进一步发现这种比例的失调主要是由于Th17的变化引起的(P<0.01),与Th1的关系不大(p>0.05).提示Th17在小鼠动脉粥样硬化斑块破裂中发挥着更重要的作用。6.Th17的主要效应分子IL-17与动脉粥样硬化斑块破裂上述结果提示Th17在斑块破裂中发挥更重要的作用,所以我们又采用(?)ELISA方法检测血清中Th17的主要效应分子IL-17的水平,发现动脉套管后14周干预组小鼠较对照组小鼠血清中IL-17的水平明显升高(P<0.001),而动脉套管后6周干预组与对照组比较无明显差异,提示我们IL-17在小鼠动脉粥样硬化斑块破裂中也起着重要的作用。免疫组织细胞化学的染色显示在斑块破裂处有高水平IL-17的存在,提示斑块局部的IL-17可能直接参与了斑块的破裂。7.Th17特异性转录因子RoRγt与动脉粥样硬化斑块破裂为了弄清Th17在动脉粥样硬化斑块破裂中的作用,我们用RT-PCR的方法检测动脉粥样硬化斑块局部的Th17特异性转录因子RORγt的表达并同时比较了Th1转录因子T-bet的表达情况,结果发现RORγt预组斑块中的表达明显高于对照组,其表达水平明显高T-bet,从另一个侧面说明Th17在动脉粥样硬化斑块的破裂发挥更重要的作用。总之,结果说明Th17/IL-17可能在促进动脉粥样硬化斑块易损性中发挥更为重要的作用,为我们研究动脉粥样硬化斑块破裂的免疫学机制辟了新的研究方向。第二部分IL-17在动脉粥样硬化斑块易损性和斑块破裂中的作用及机制研究方法一、Th17/IL-17对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响1.Apo E-/-小鼠30只,于8周给予高脂饲料喂养,10周行左侧颈动脉套管缩窄手术。于动脉套管后8周给ApoE-/-小鼠腹腔注射IL-17(1u/只,每周1次),对照组同时腹腔注射生理盐水。分别注射2周,4周,6周。2.取小鼠左侧颈动脉斑块及主动脉根部制备连续石蜡及冰冻切片,苏木素-伊红染色、油红O染色以及免疫组织化学染色观察巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)的局部表达。测量斑块面积、血管面积和纤维帽厚度；测量胶原、脂质、平滑肌细胞、巨噬细胞免疫组化阳性染色面积,并计算它们占斑块面积的比例。计算易损指数。二、IL-17干预后不同Th亚群的变化1.ApoE-/-小鼠30只,于8周给予高脂饲料喂养,10周行左侧颈动脉套管缩窄手术。于动脉套管后8周给ApoE-/-小鼠腹腔注射IL-17(1ug/只),对照组同时腹腔注射生理盐水。分别注射2周,4周,6周。2.分别取不同组小鼠的脾脏制备脾细胞悬液,进行多种标记。3.流式细胞术检测小鼠脾脏中Thl,Thl7和Treg细胞的比例变化。三、IL-17体外干预1.体外培养小鼠平滑肌细胞系Movas,分别给予不同浓度的IL-17(25ug/ml,50ug/ml,100ug/ml)刺激不同时间(24、48、72小时)。2. Hochest检测刺激后细胞的凋亡率。3.流式细胞术检测刺激后细胞的凋亡率AnnexinV/PI。4.应用Western blot方法检测刺激后细胞凋亡相关蛋白caspase-3活性变化。结果一、外源性IL-17对动脉粥样硬化斑块易损性的影响为了进一步证实Th17/IL-17在动脉粥样硬化斑块易损性和斑块破裂中的作用,我们于颈动脉套管后8周开始给予ApoE-/-小鼠腹腔注射IL-17,分别于治疗后2周、4周及6周处死小鼠,取外周血检测对脂质代谢的影响,取左颈总动脉制作切片,HE染色观察斑块大小,油红O染色观察脂质沉积以及免疫组化染色检测巨噬细胞和平滑肌细胞在斑块局部的表达。结果显示整个治疗过程小鼠一般状况良好,进食、活动和精神状态未见异常,体重及血脂与对照组未见明显变化。IL-17治疗2周后,小鼠颈动脉的斑块大小、纤维帽、脂核面积及纤维帽与坏死核比值与对照组比较均无明显改变；IL-17治疗后4周,斑块面积较对照组增大、纤维帽变薄,尽管脂核面积无明显差异,但帽/核比值明显降低(P<0.05)；IL-17治疗6周斑块大小与对照组比较没有明显改变,但纤维帽面积减低,脂核明显增大(P<0.05),帽／核比值显著降低(P<0.01),指出外源性IL-17治疗可明显增加斑块的易损性。二、外源性IL-17干预后对小鼠动脉粥样硬化斑块破裂的影响外源性IL-17干预2周,治疗组和对照组术见明显斑块破裂；干预4周组,5只治疗组小鼠2例斑块内出现埋入式纤维帽斑块,对照组没有破裂的指证：5只干预6周组小鼠有1例斑块内出血、有3例出现斑块内埋入式纤维帽,但同龄对照组小鼠仅有1只出现斑块内埋入式纤维帽,由于斑块内埋入式纤维帽是斑块破裂后修复后的指证,所以这些结果证明了外源性IL-17干预不仅可增加动脉粥样硬化斑块易损斑块形成并可诱导斑块破裂。三、外源性IL-17干预不同时间后对外周CD4+T细胞亚群的影响为了进一步明确外源性IL-17治疗对免疫反应的影响,我们又分别分析了外源性IL-17干预后,系统调节性T细胞、Thl和Th17细胞的变化。1.调节性T细胞(Tregs)在IL-17干预后的比例变化为了研究外源性IL-17对Tregs的影响,我们采用流式细胞术的检测方法,检测了注射IL-172周、4周及6周组和对照组小鼠脾细胞中调节性T细胞的比例。结果发现IL-17治疗2周、4周和6周显著降低系统性CD4+Foxp3+CD25+T细胞亚群的比列,而上调CD4+FOxp3+CD25-T细胞亚群的比例变化(P<0.05),提示IL-17不仅可直接促进斑块易损性而月.可通过改变Treg数量间接发挥作用。2.Thl细胞在IL-17干预后的比例变化结果显示注射IL-17后2周和4周组Thl变化没有明显统计学意义,而注射IL-176周组Thl明显减少,这些结果和以前在在其他模型方发现IL-17可抑制Thl产生的结果吻合,这也从另一个方面说明IL-17的增强的斑块易损性和斑块破裂和Th1没有关系。3.Th17细胞在IL-17干预后的比例变化我们发现治疗2周、4周和6周小鼠脾脏Th17细胞的比例均较对照组均明显升高(P<0.01夕。我们前期研究显示IL-17可活化巨噬细胞分泌高水平的IL-6,大量的研究已经证明在TGF-β和IL-6的存在下,Th细胞优先向Th17分化,可见外源性IL-17不仅可直接促进斑块易损性而且可通过上调促进Th17细胞分化进一步促进斑块易损性的作用和斑块的破裂。4. Th1+Th17/Treg、Th1/Treg、Th17/Treg比例在IL-17干预后的变化进一步我们分析了IL-17干预对Th1+Th17/Treg (CD4+CD25+Foxp3+T)、 Th1/Treg、Th17/Treg比例的影响,统计结果发现IL-17治疗2周、4周、6周均明显升高了Th17/Treg比例(P<001,),而对Th1/Treg比列的影响不大,上述结果说明外源性IL-17干预后主要是通过上调Th17和下调Treg (CD4+CD25+Foxp3+T),进而改变Th17/Treg平衡,Th17/Treg的失衡促进了动脉粥样硬化斑块易损性,加速了斑块的破裂。四、外源性IL-17体外处理可以增强平滑肌细胞的凋亡已知斑块纤维帽平滑肌的凋亡,是动脉硬化斑块易损性和破裂的重要机制之一,为了进一步明确IL-17促进斑块易损性的机制,我们采用体外培养Movas细胞,给予不同浓度IL-17培养24,48及72小时,采用Hochest染色在荧光显微镜下观察了凋亡小体的产生,AnnexinV/PI染色用流式细胞术检测凋亡率,采用Western Blot的方法检测的凋亡相关分子Caspase3(?)的表达。三种方法均显示IL-17在体外能够促进平滑肌细胞的凋亡,这种作用具有时间和浓度依赖性。结论1.建立了小鼠动脉粥样硬化斑块破裂模型,为研究斑块破裂提供了模型在高脂喂养的基础上,利用在ApoE-/-小鼠的颈动脉套置缩窄性套管的方法,诱发动脉粥样硬化斑块形成,再通过LPS、冰水刺激和苯肾上腺素联合作用的方法在短时间内促进斑块发生破裂,具有高效、易于掌握斑块破裂的时间点并伴发血栓形成等特点,相似于人类病变。2.发现多种CD4+T细胞亚群参与动脉粥样硬化斑块破裂,其中Th17及其主要效应分子IL-17可能更为重要我们发现动脉粥样硬化斑块破裂破裂时,Treg、Th1和Th17均发生改变,但Thl7不(?)PTh17/Treg比列的改变更加明显,斑块破裂时循环IL-17升高,斑块局部有高水平IL-17的表达,提示Th17和其主要效应分子IL-17在动脉粥样硬化斑块破裂中发挥着更为重要的作用。3.Th17的主要效应分子IL-17具有促进斑块易损性和斑块破裂的作用外源给予Thl7的主要效应分子IL-17可以有效降低动脉粥样硬化斑块的稳定性和促进斑块破裂,证明Th17/IL-17具有促进动脉粥样硬化斑块易损性的作用,4.IL-17诱导平滑肌细胞凋亡是IL-17促进斑块易损性的机制之一体外实验证实IL-17可以导致平滑肌细胞凋亡增加,说明IL-17促进动脉粥样硬化斑块易损性增加可以通过促进平滑肌细胞的凋亡来实现的。5.1L-17治疗导致的Th17/Treg失衡可能是IL-17增加斑块的易损性的另一机制我们发现外源性IL-17于预后可通过上调Th17和下调Treg,进而改变Th17/Treg平衡,故提示IL-17治疗引起Th17/Treg的失衡可能是其促进动脉粥样硬化斑块易损性、加速斑块破裂的另一个机制。创新性和意义1.建立了一种新的动脉粥样硬化斑块破裂小鼠模型,为研究动脉粥样硬化斑块破裂的机制和探索干预方法提供了新的手段由于目前前国际上尚无理想的斑块破裂的的小鼠模型,为了研究不同细胞亚群在动脉粥样硬化易损中的作用,我们在参考已有研究的基础上,改进了建模方法,建立了一种动脉粥样硬化斑块破裂小鼠模型,该模型具有高效、易于掌握斑块破裂的时间点的特点,并伴发血栓形成,相似于人类病变,为矼究动脉粥样硬化斑块破裂的机制和探索干预方法提供了新的模型。2.发现Th17在动脉粥样硬化斑块破裂中发挥更为重要的作用,证明外源性IL-17具有增加斑块易损性、促进斑块破裂的作用,为动脉粥样硬化斑块破裂的治疗提供了新的靶点。近两年,我们和其他学者的研究显示Th17具有促进斑块形成的作用,但在斑块破裂中的作用尚不清楚。本研究在斑块破裂模型发现尽管Treg、Th1参与斑块破裂的发生,但Th17及其主要效应分子发挥更重要的作用；进一步通过外源性IL-17治疗确定IL-17具有促进动脉粥样硬化易损性和斑块破裂的作用,为动脉粥样硬化斑块破裂的治疗提供了新的靶点。3.发现IL-17不仅可直接诱导平滑肌细胞凋亡而且可通过影响Th17/Treg平衡促进斑块的破裂,为揭示IL-17的作用机制提供新的思路本研究首次发现IL-17可以导致平滑肌细胞凋亡增加,并可通过上调Th17和下调Treg,进而改变Th17/Treg平衡,对揭示Thl7和IL-17促进动脉粥样硬化斑块破裂的机制研究提供了新的思路。研究的局限性1.动脉粥样硬化斑块破裂模型仍不完善,使进一步研究受到一定的限制。2.IL-17促进斑块破裂的机制尚有待深入研究