好食脉孢菌(N.sitophila)产锰过氧化物酶培养条件的优化、酶的纯化以及酶学性质的分析

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好食脉胞菌属于子囊菌的粪壳菌科,对木质素具有较高的降解能力。以前的学者对好食脉胞菌降解木质素的过程原理进行过详细研究,并对其产生的木质素过氧化物酶进行了分离纯化和性质研究,然而对好食脉孢菌产生的锰过氧化物酶尚未见详细报道。 本研究对好食脉胞菌培养液中的三种主要木质素降解酶进行了活性分析,得出了它们的产酶曲线,曲线显示,三种酶中以LiP的活性最高,在培养的第6天达到6.45U/ml;其次为MnP,在第三天时活性为0.4U/ml;漆酶的活性很微弱。为了得到感兴趣的锰过氧化物酶,首先对好食脉胞菌的培养条件进行了优化探索,优化因素包括:碳源氮源的比例、碳源氮源的种类、培养的起始pH值、锰离子的影响等;并针对碳源、氮源、Mn2+三个因素设计了正交实验,考查了不同培养条件下的酶活。结果表明:(1)在低碳高氮的情况下有助于产酶;锰离子的添加对酶活没有影响,却能够诱导其他酚过氧化物酶的表达,这些结论与文献报道的一般情况有所不同。(2)在pH值为6.0,以2g/L木质纤维素和0.5g/L葡萄糖为碳源,以1g/L酒石酸铵和1g/L酵母抽提物为氮源时,氧气充足的条件下,菌体的生长效果最好,锰过氧化物酶的活性达到了0.8U/L,比优化前提高了2倍。 为了对该菌产生的锰过氧化物酶进行深一步的研究,采用DEAE阴离子柱对发酵上清进行了初步的纯化工作。纯化结果表明pH 6.0的0.3M乙酸缓冲液的洗脱峰为活性峰;SDS-PAGE电泳结果显示该峰主要有四条蛋白带组成,其中分子量为65.9KD、52.6KD、38.5KD的三条带,经检测有锰过氧化物酶活性,并以分子量为38.5KD的蛋白质活性最高。进一步的实验发现,这三种蛋白质在无锰离子的情况下也可以氧化DMP底物,但仅显示原活性的60%;三种蛋白质单独存在时的酶活,均比混合存在时有明显提高。 通过对纯化出的MnP3进行酶学性质分析,此酶的最适反应温度为60℃,最佳PH值为5.0,锰离子的浓度为2mM时反应的速度最大。Cu2+、Fe2+、Fe3+对酶活都有促进作用,Zn2+、Ba2+、Mg2+对酶活有抑制作用。但是此酶的温度稳定性较差,随着温度的升高失活很明显。
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