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仔猪腹泻是养猪业的一种常见多发病,该病给我国和世界养猪业造成巨大的经济损失。流行病学调查显示,仔猪腹泻通常是多种病原体混合感染引起的。尽管近年来有关肠道病原体混合感染的报道不少,但病原体混合感染、发挥生物协同作用、加重腹泻的作用机制知之甚少。猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic coli K88,ETEC K88)是引起仔猪腹泻的主要病原,临床中已出现二者混合感染且加重仔猪腹泻的疫情。因此研究TGEV与ETEC K88的共感染机制势在必行。本研究首先利用猪小肠上皮细胞(Intestinal porcine epithelial cells,IPEC-J2)作为体外感染细胞模型,分别用 TGEV、ETEC K88 和 TGEV-ETEC K88 感染 IPEC-J2 细胞,对 TGEV 和 ETEC K88 之间的相互影响及细胞的蛋白组学进行分析。接着,我们探究TGEV感染后促进ETEC K88对肠上皮细胞粘附的机制,对TGEV如何诱导肠上皮细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、促进 ETEC K88 粘附进行了深入探索。最后采集TGEV感染后耐过仔猪的小肠,对小肠的间质化、病理学变化和相关免疫功能进行研究,探讨TGEV促进病原体继发感染其他机制,以期为预防和治疗病原体混合感染引起的仔猪腹泻提供新思路。本研究内容分为以下三个部分:1 TGEV和ETEC K88共感染IPEC-J2细胞后蛋白组学分析本试验分别用TGEV和ETEC K88感染IPEC-J2细胞,体外建立TGEV-ETEC K88共感染细胞模型,对两个病原体之间增殖的相互影响、细胞相应的蛋白组学变化进行分析。结果发现,TGEV感染后可促进ETEC K88对IPEC-J2细胞的粘附,而ETEC K88则抑制TGEV在细胞中的复制增殖。TGEV感染显著增加炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)mRNA的表达,TGEV-ETEC K88共感染也促进炎性细胞因子的表达,但是低于TGEV感染组,高于ETEC K88感染组。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)联合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术检测各个感染组蛋白组学变化,与空白对照组相比,TGEV感染组、ETEC K88感染组和TGEV-ETEC K88感染组分别有77、89和136个蛋白发生了显著变化。分析蛋白组学数据,着重对整合素α5(integrin α5)进行探索。TGEV-ETEC K88显著促进integrin α5表达增加,integrin α5的激动剂和抑制剂验证了 integrin α5在TGEV促进ETEC K88粘附中发挥作用。结果表明:TGEV感染肠上皮细胞后增加ETEC K88的粘附;蛋白组学分析显示,integrin α5可能在TGEV促进ETEC K88粘附中发挥作用。本研究首次应用iTRAQ联合LC-MS/MS技术对TGEV和ETEC K88共感染肠上皮细胞的差异蛋白组学进行分析,为深入了解二者共感染的致病机制提供理论依据。2 TGEV持续感染通过诱导肠上皮细胞发生间质化促进ETEC K88的粘附TGEV感染后耐过仔猪长期带毒、排毒,很容易受到病原菌的继发感染。我们推测可能跟TGEV持续感染诱导肠上皮细胞发生上皮间质转化有关。因此,本试验首先证明TGEV是否可以在体外持续感染IPEC-J2细胞;其次根据细胞形态学、上皮细胞间质化标志蛋白的变化等,判断TGEV是否诱导IPEC-J2细胞发生间质化;再次研究TGEV如何诱导IPEC-J2细胞发生间质化;,最后探索TGEV诱导上皮细胞发生间质化与促进ETEC K88粘附之间的关系。结果发现,低剂量的TGEV感染IPEC-J2细胞后连续传代,病毒可以持续感染肠上皮细胞;细胞上清中有病毒粒子的释放。TGEV持续感染IPEC-J2细胞后诱导细胞发生间质化,并伴随着一些细胞特性的改变:细胞形态发生改变,由多边形铺路石状变为长梭形;间质细胞标志基因和蛋白表达增加,上皮细胞特性减少或消失;细胞对细胞外基质粘附能力减弱;细胞的迁移和增殖能力有所提高;细胞的吞噬能力也显著增强。此外,TGEV持续感染也促进了炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TGF-β 和 TNF-α 的 mRNA 表达。进一步研究表明,TGEV 持续感染激活TGF-β,通过PI3K/AKT和ERK信号通路,诱导上皮细胞发生间质化。TGEV持续感染促进ETEC K88对肠上皮细胞的粘附,integrin α5和纤连蛋白(fibronectin)的表达也显著增加;逆转间质转化进程,则减少ETEC K88的粘附以及integrin α5和fibronectin的表达。上述结果表明,TGEV持续感染激活TGF-β,通过PI3K/AKT和ERK信号通路,诱导上皮细胞发生间质化,促进integrin α5和fibronectin的表达,增加ETEC K88的粘附,进而有利于细菌的继发感染。该发现为临床预防和治疗混合感染引起的仔猪腹泻提供新思路。3 TGEV感染后耐过仔猪小肠的变化TGEV主要感染猪小肠上皮细胞,造成肠上皮细胞坏死、脱落和绒毛萎缩。一般的研究都侧重于TGEV引起的急性肠道感染,那么TGEV感染后对耐过仔猪的肠道会产生什么影响呢?目前尚无相关报道。我们采集了自然感染TGEV后耐过仔猪的小肠样品进行研究。Western blot检测发现E-cadherin的表达降低,而vimentin、integrinα5和fibronectin的表达增加,表明TGEV诱导耐过仔猪小肠发生了间质化;对小肠进行组织病理学观察,发现小肠绒毛萎缩,绒毛高度和隐窝深度都有所降低,派尔氏斑(Peyer’s patches,PPs)发生萎缩;免疫组化研究相关免疫细胞发现,小肠中SIgA阳性细胞、CD3+T细胞和树突状细胞(dendritic cells,DCs)的数目也显著减少;回肠处微皱褶(microfold cells,M cells)细胞的数量和小肠上皮细胞的增殖能力却显著增强;qPCR检测细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β)的分泌显著增加。结果表明,TGEV感染后诱导耐过仔猪的小肠发生间质化,此外降低小肠的免疫功能,可能有利于病原体的继发感染。