论文部分内容阅读
[目的]:本研究旨在通过体内外实验观察星形胶质细胞中的应激反应基因NDRG2在神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)中的表达改变,并研究在NP发生和发展过程中,NDRG2能否调节星形胶质细胞的激活,以及通过JAK/STAT通路参与EAAT2的调控作用,并探讨其相关机制。[方法]:实验一:雄性SD大鼠42只随机分为假手术组(Sham组,n=6)和SNL组(n=36),SNL组实施L5脊神经结扎,Sham组仅暴露脊神经不结扎。分别测定术前1天和术后第1、3、7、10、14和21天的术侧后爪机械痛阈(MWT)和热痛阈(TWL)。SNL组在每个相应时点痛阈值测试后分别处死,采用Western blot与qPCR检测术侧脊髓背角内NDRG2蛋白含量与mRNA表达量,采用Immunofluorescence(IF)检测术前以及术后第10天脊髓背角内NDRG2和GFAP的荧光表达。实验二:雄性SD大鼠36只,行腰椎鞘内置管术后随机分为3组(n=12):Sham+生理盐水组、Sham+氟代柠檬酸(Fluorocitrate,FC)组和 Sham+NDRG2干扰腺病毒(AD-NDRG2-RNAi)组,分别在给药前1天和给药后3、7、10天进行旷场实验(Open field test,OFT)评估大鼠的运动功能。实验三:144只雄性SD大鼠行腰椎鞘内置管后随机分为6组(n=24):Sham+生理盐水组(Sham+Veh 组)、Sham+AD-NDRG2-RNAi 组(Sham+AD 组)、Sham+氟代柠檬酸组(Sham+FC组)、SNL+生理盐水组(SNL+Veh组)、SNL+AD-NDRG2-RNAi 组(SNL+AD 组)和 SNL+氟代柠檬酸组(SNL+FC 组)。第一批大鼠(每组n=12)分别用于测定SNL术前1天、术后第1、3、7和10天大鼠术侧足底MWT和TWL;第二批大鼠(每组n=12)用于术后第10天行为学结束后处死,Western blot检测脊髓背角内NDRG2、GFAP和EAAT2水平,qPCR检测NDRG2和EAAT2 mRNA表达变化,IF检测脊髓背角内NDRG2,GFAP的共定位表达,ELISA检测脊髓背角内炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10)的表达变化。实验四:提取并培养大鼠原代大脑星形胶质细胞,分为4组:正常星形胶质细胞组(Con+Veh)、正常星形胶质细胞+AD-NDRG2-RNAi组(Con+AD)、正常星形胶质细胞+脂多糖组(LPS+Veh)和星形胶质细胞+脂多糖+AD-NDRG2-RNAi组(LPS+AD)。Western blot检测NDRG2、GFAP和EAAT2蛋白表达,IF检测NDRG2、GFAP和EAAT2荧光表达,ELISA检测细胞中炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10)的表达变化。实验五:将大鼠原代星形胶质细胞分为4组:正常星形胶质细胞组(Con+Veh)、正常星形胶质细胞+AG490组(Con+AG490)、正常星形胶质细胞+脂多糖组(LPS+Veh)和星形胶质细胞+脂多糖+AG490组(LPS+AD)。分别对四组细胞进行Western blot检测NDRG2、GFAP、EAAT2、p-STAT3和t-STAT3蛋白表达。[结果]:SNL引起大鼠MWT和TWL均明显降低,伴随脊髓背角内NDRG2表达明显增加,在术后第10天表达最高。脊髓背角内NDRG2和GFAP免疫荧光共表达。鞘内注射AD-NDRG2-RNAi和FC能改善SNL术后第7到10天的痛觉过敏。SNL引起脊髓背角内GFAP与NDRG2表达明显增加,EAAT2表达明显降低。鞘内注射AD-NDRG2-RNAi和FC明显降低SNL术后第10天NDRG2与GFAP表达,增加EAAT2表达。且SNL引起脊髓背角内星形胶质细胞的激活,表达增加的NDRG2与GFAP荧光共表达。SNL引起脊髓背角内TNF-α、IL-1β和IL-6表达明显增加,IL-4表达明显降低,IL-6/IL-10明显增加。鞘内注射AD-NDRG2-RNAi使脊髓背角内TNF-α、IL-1β和IL-6表达明显降低,IL-4和IL-10表达明显增加,IL-6/IL-10明显降低。AD-NDRG2-RNAi预处理的星形胶质细胞中GFAP表达明显增加,NDRG2和EAAT2表达明显降低;LPS刺激引起星形胶质细胞GFAP和NDRG2表达明显增加,EAAT2表达明显降低,TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10表达均显著升高。AD-NDRG2-RNAi预处理的星形胶质细胞在LPS刺激条件下,与单纯LPS刺激的细胞相比GFAP和NDRG2表达明显降低,EAAT2表达明显增加,TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10表达均显著降低,星形胶质细胞中GFAP分别与NDRG2和EAAT2免疫荧光共表达。JAK/STAT抑制剂AG490预处理的星形胶质细胞内GFAP、NDRG2和p-STAT3蛋白含量明显降低;LPS刺激导致星形胶质细胞内GFAP、NDRG2和p-STAT3表达明显增加,EAAT2表达明显降低;AG490预处理的星形胶质细胞在LPS刺激条件下与单纯LPS刺激的细胞相比GFAP、NDRG2和p-STAT3表达明显降低,EAAT2表达明显增加。[结论]:NDRG2在NP过程中表达改变,可能参与调控星形胶质细胞的激活,并调控NP状态下炎症因子的表达变化。NDRG2可能通过JAK/STAT信号通路,调控星形胶质细胞胞膜上的EAAT2的表达改变,从而影响突触间隙中谷氨酸的代谢调节。