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牛胚胎干细胞一直未能成功建系,在其培养过程中培养液的选择、饲养层的选择、获得内细胞团的途径等等多种因素影响着牛胚胎干细胞的生长。确定一种适合的培养体系及传代方法对牛胚胎干细胞的成功建系有着非常重要的意义。本研究从制备饲养层、确定传代方法及培养液中抑制分化因子的添加等几个方面来确定适合于来自体外受精胚胎的牛类胚胎干细胞的生长体系,并采用形态鉴定、碱性磷酸酶染色、类胚体形成,免疫荧光染色等方法对牛类胚胎干细胞进行检测。1.采用胰酶消化法和组织块贴壁法分别获得原代胎鼠和牛胎儿成纤维胞,运用三种不同的传代方法和四种不同的冷冻复苏方法对两种成纤维细胞进行培养。结果显示使用方法一(不对其离心,细胞刚刚消化变圆便将胰酶吸出,再进行传代)对成纤维细胞传代时,细胞贴壁率较高、后期的培养中细胞生长活力较好；使用方法四(复苏后不离心,在细胞贴壁后及时更换细胞的培养液)对成纤维细胞冷冻复苏时,细胞的贴壁率较高且形态较好,在后期的生长中活力也较好。所以,采用方法一对成纤维细胞传代、方法四对其冷冻复苏有利于成纤维细胞的生长。2.在上述两种成纤维细胞为饲养层的条件下,采用含10%胎牛血清、0.1mMβ-巯基乙醇、O.1mM非必须氨基酸、100IU／ml青霉素、0.05mg／ml链霉素、20ng/mlLIF和10ng／mlbFGF的DMEM F12培养液培养牛类胚胎干细胞,通过形态鉴定和碱性磷酸酶染色检测来寻找一种适合于牛类胚胎干细胞培养的饲养层。结果显示在相同的培养体系条件下培养牛类胚胎干细胞,以胎鼠成纤维细胞为饲养层的贴壁率显著高于以牛胎儿成纤维细胞为饲养层的贴壁率(P<0.05),且后期的生长状态较好。结果表明以胎鼠成纤维细胞为饲养层有利于牛类胚胎干细胞的培养。3.在以胎鼠成纤维细胞为饲养层的条件下,采用含10%胎牛血清、O.1mMβ-巯基乙醇、0.1mM非必须氨基酸、100IU／ml青霉素、0.05mg／ml链霉素、20ng/ml LIF和10ng/ml bFGF的DMEM F12培养液,使用机械传代法和胰酶消化法培养牛类胚胎干细胞。结果显示采用机械传代法益于牛类胚胎干细胞的培养,而胰酶消化法传代牛类胚胎干细胞最多传至第三代即分化消失。结果表明在牛类胚胎干细胞的培养时机械传代法更利于其生长。4.以胎鼠成纤维细胞为饲养层,采用机械传代法传代,用三种不同的培养液(即培养液中添加20ng/mlLIF、10ng/mlSCF+20ng／mlLIF、10ng／ml SCF)培养牛类胚胎干细胞,来确定LIF、SCF因子对牛类胚胎干细胞培养的影响,从而为寻找牛胚胎干细胞培养的合适因子奠定基础。结果显示,添加10ng／mlSCF+20ng／mlLIF的培养液的胚胎贴壁率明显高于添加10ng／ml SCF的培养液(P<0.05)；添加20ng／mlLIF的培养液与添力10ng/ml SCF+20ng/ml LIF和10ng/mlSCF的培养液的胚胎贴壁率均无明显差异；在后期的传代培养过程中添加20ng／mlLIF和添加10ng／mlSCF+20ng／mlLIF的两种培养液所培养的牛类胚胎干细胞生长形态类似,10ng/ml SCF+20ng/ml LIF培养液培养的牛类胚胎干细胞生长速度相对较快,且都保持着牛类胚胎干细胞的分化潜能,而添加10ng／mlSCF所培养的牛类胚胎干细胞最多生长至第五代即以全部分化消失。结果表明一定浓度的LIF和SCF对牛类胚胎干细胞的生长有促进作用。