【摘 要】
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V-ATP酶（vacuolar ATPase）又称液泡ATP酶，广泛分布于真核生物细胞的囊泡、溶酶体、突触小泡、内体、高尔基体等内膜系统上，将H+从细胞质泵到胞外或者从细胞质泵到细胞器囊腔内，来维持细胞质的中性pH、细胞外或者细胞器囊腔内的酸性pH，从而为某些生化反应提供特定的pH环境。V-ATP酶活性的有效调控对细胞的生存非常重要，RAVE （regulator of the H+-ATPase
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V-ATP酶（vacuolar ATPase）又称液泡ATP酶，广泛分布于真核生物细胞的囊泡、溶酶体、突触小泡、内体、高尔基体等内膜系统上，将H+从细胞质泵到胞外或者从细胞质泵到细胞器囊腔内，来维持细胞质的中性pH、细胞外或者细胞器囊腔内的酸性pH，从而为某些生化反应提供特定的pH环境。V-ATP酶活性的有效调控对细胞的生存非常重要，RAVE （regulator of the H+-ATPase of vacuolar and endosomal membrane）对V-ATP酶可逆分解和组装的调控是V-ATP酶活性的重要调节机制。RAVE复合物由Rav1p （155kDa）、Rav2p （40kDa）、Skp1p （22kDa）三个亚基所组成。目前，RAVE复合物的三维空间结构和性质尚未得知，RAVE复合物调节V-ATP酶活性的分子机制的也尚未阐明。本实验以酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板，分别扩增得到Rav1p的基因rav1和V-ATP酶C亚基的基因vma5，分别构建重组质粒pACYCDuet-rav1、pET28a-rav1和pET21a-vma5。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，经优化发现，Rav1p的最佳表达条件为：37°C培养细胞到OD600为0.6时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，16°C、100r/min诱导30h。Vma5p的最佳表达条件为：37°C培养细胞到OD600为0.6时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37°C诱导5h。利用1mL His-Trap亲和层析柱纯化His-Tag融合蛋白，SDS-PAGE分析和westernblot结果显示，只有N端含His-Tag的Rav1p不能被纯化；N端和C端都含His-Tag的Rav1p能够吸附到Ni-NTA树脂，用500mmol/L的咪唑将其洗脱并纯化；对于C端含His-Tag的目的蛋白Vma5p，300mmol/L的咪唑就能将其从Ni-NTA树脂上洗脱并纯化。将Rav1p的氨基酸序列进行SWISS-MODEL同源建模，发现Rav1p与其他WD40蛋白家族成员（如G蛋白的β亚基、SCF泛素连接酶中的Cdc4p等）一样，能够形成β-propeller结构域。β-propeller结构域在WD40蛋白家族中的共同功能是，参与多亚基复合体的组装和蛋白蛋白之间的相互作用。由此推测，RAVE复合物通过Rav1p的β-propeller结构域与V-ATP酶的E、G和C亚基（Vma5p）发生可逆的蛋白相互作用，来调节V-ATP酶的可逆分解与组装，从而实现对V-ATP酶活性的高效调控。
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