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目的:多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种妇科常见的内分泌疾病,也是女性不孕症的主要原因之一,在育龄妇女中发病率约7%～9%。其临床表现异质性,不但严重影响患者的生殖功能,而且使雌激素依赖性肿瘤发病率增加,相关的代谢失调包括高雄激素血症、胰岛素抵抗、糖代谢异常、脂代谢异常,导致2型糖尿病和心血管疾病的发病率也增加。目前为止,仍不能准确地说明引发PCOS的具体因素,现阶段的研究发现,病因主要集中在以下几方面:遗传因素、环境因素、高雄激素分泌、肥胖、炎症、青春期发育亢进等。之前有研究表明血管生成在PCOS的发生、发展中起重要作用,卵巢血管增生与扩张、血流丰富是PCOS的显著特征,PCOS的发生与血管生成相关因子的调节障碍有关。有证据表明,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作为重要的血管生成因子参与PCOS的发生,有研究发现VEGF在PCOS中表达上调。Di Pietro等已证实VEGF水平可能影响PCOS大鼠卵泡发育和卵巢血管生成。VEGFA(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是VEGF家族成员之一,是最主要的血管内皮生长因子。MicroRNA是一类内源的非编码的RNA,其长度大约为22-24个核酸。目前的研究显示microRNA参与了众多的生理病理机制,是功能强大的一类调节性RNA。然而我们对microRNA对卵泡发育及PCOS病程的影响还知之甚少,因此研究microRNA在该领域的调节机制有利于深入了解PCOS的病理机制,有利于探索可能的治疗靶点。MiR-185包括mi R-185-5p与miR-185-3p,一般情况下miR-185是指miR-185-5p,miR-185-3p往往被降解不参与生物学过程。大量研究发现miR-185可能参与了包括肿瘤、脂质代谢、精神疾病、肝纤维化、心脏疾病、肺部疾病在内的诸多疾病的发生发展。2015年Bo Xu等人的报道显示miR-185-5p在PCOS患者卵巢组织表达下降,但并没有进一步的具体研究。生物信息学预测发现VEGF可能是miR-185-5p的靶点,然而,miR-185-5p在调节PCOS发病机制中的确切功能尚待阐明。我们假设miR-185-5p的下降,增加VEGFA在卵巢内的表达,促进卵巢组织血管异常生成,参与PCOS的进程。本研究中,我们用经典PCOS模型局部注射携带miR-185-5p的慢病毒以研究miR-185-5p的作用,然后建立VEGF诱导的人卵巢微血管内皮细胞(human ovarian microvascular endothelial cell,HOMEC),进一步探讨miR-185-5p对血管生成的潜在机制及对PCOS疾病进程的影响。方法:利用皮下注射脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)的方法建立大鼠PCOS模型,DHEA注射3周后,测量动物的胰岛素抵抗指数(The homeostasis model assessment of insulin resistence,HOMA-IR),并选择HOMA-IR>2.8的大鼠作为建模成功的PCOS大鼠。将雌性SD大鼠分为4组:(1)正常对照组(2)PCOS组(3)PCOS+NC组(感染阴性对照慢病毒的PCOS大鼠)(4)PCOS+rno-miR-185-5p组(感染rno-miR-185-5p过表达慢病毒的PCOS大鼠),每组6只。构建载有rno-mi R-185-5p及其对照的慢病毒,按组别经卵巢被膜下注射相应慢病毒,注射2周后葡萄糖灌胃采血,然后处死大鼠取卵巢组织。利用HE染色方法检测大鼠卵巢组织的病理学改变,real-timePCR检测miR-185-5p、VEGFA mRNA在各组大鼠卵巢组织中的表达水平,ELISA检测卵巢组织中血管生成相关因子VEGFA、血管生成素(angiopoietin,ANGPT)1、ANGPT2、血小板衍生因子(platelet-derived growth factor,PDGF)B和PDGFD的含量,免疫组化检测各组大鼠卵巢组织CD34、α-平滑肌收缩蛋白(α-smooth muscle cell actin,α-SMA)蛋白表达。采用工程细胞293T细胞,利用萤光素酶报告基因方法分别检测hsa-、rno-miR-185-5p与VEGFA的结合。购买并培养人卵巢微血管内皮细胞,构建hsa-miR-185-5p及其对照的慢病毒载体,感染细胞,然后分为3组:(1)对照组(2)LV-NC组(3)LV-hsa-miR-185-5p组,感染72小时后,Real-time PCR检测各组细胞miR-185-5p表达,确认感染成功后利用Real-time PCR和Western blot检测各组细胞内VEGFA mRNA和蛋白表达。感染成功后(72小时后)将细胞分为6组::(1)对照组(2)LV-NC组(3)LV-hsa-miR-185-5p组(4)VEGFA组(5)LV-NC+VEGFA组(6)LV-hsa-mi R-185-5p+VEGFA组,含VEGFA组加入重组人VEGFA100ng/ml,分别在0、24、48、72和96小时进行MTT检测,分别在24、48小时进行Transwell细胞迁移实验,在24小时进行成管实验。结果:Real-time PCR检测miR-185-5p在各组大鼠卵巢组织中的表达水平,与对照组相比,PCOS组miR-185-5p表达量明显降低,给予rno-miR-185-5p后miR-185-5p表达量增加。检测各组大鼠的胰岛素抵抗情况、绘制胰岛素水平曲线、计算HOMA-IR,结果显示,PCOS组较对照组HOMA-IR和胰岛素水平显著增加,给予rno-miR-185-5p后HOMA-IR和胰岛素水平显著减少。HE染色检测大鼠卵巢组织的病理学改变,对照组存在不同阶段的卵巢结构完整性、多个黄体和卵泡,PCOS及PCOS+NC组可见较多囊性扩张的卵泡、颗粒细胞层减少和黄体减少、卵泡内卵母细胞或放射冠消失,PCOS+rno-miR-185-5p组减轻了卵巢的形态学损伤并增加了颗粒细胞层。Real-time PCR检测VEGFA mRNA在各组大鼠卵巢组织中的表达水平,PCOS建模后VEGFA mRNA表达量与对照组比较显著增加,而PCOS+rno-miR-185-5p组VEGFA mRNA表达量明显少于PCOS+NC组。ELISA检测卵巢组织中血管生成相关因子含量,结果显示,与对照组相比PCOS组VEGFA和ANGPT1含量显著增加,而ANGPT2、PDGFB和PDGFD的含量明显降低,与PCOS+NC组相比,PCOS+rno-mi R-185-5p组VEGFA和ANGPT1含量显著减少,ANGPT2、PDGFB和PDGFD的含量增加。免疫组化结果显示,PCOS组的CD34、α-SMA的表达水平明显高于对照组,PCOS+rno-miR-185-5p组CD34、α-SMA的表达水平明显低于PCOS+NC组。荧光素酶报告基因测定结果表明,miR-185-5p能够通过结合VEGFA的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR),抑制其表达。体外实验结果显示,注射相应慢病毒后,与对照组相比,hsa-miR-185-5p组HOMEC中miR-185-5p mRNA表达显著增加,VEGFA mRNA和蛋白的表达均显著降低。MTT检测各组细胞增殖情况,结果发现转染miR-185-5p后细胞增殖能力降低,而加入VEGFA后,细胞增殖能力得到恢复。检测各组细胞的迁移和细胞血管生成能力,结果发现与对照组相比,has-miR-185-5p组迁移细胞个数和成管数量明显减少,而与has-miR-185-5p组比较has-miR-185-5p+VEGFA组迁移细胞个数和成管数量增加。结论:本研究表明miR-185-5p在PCOS大鼠卵巢组织中表达下调。过表达miR-185-5p可以改善PCOS大鼠胰岛素抵抗、高血清胰岛素水平和卵巢结构损伤。我们发现miR-185-5p能够抑制PCOS大鼠卵巢组织的血管过度生成与成熟。体外实验也进一步证明miR-185-5p通过直接靶向VEGFA抑制血管内皮细胞的增殖、迁移及小管形成能力。综上,本研究表明mi R-185-5p可通过与VEGFA相互作用来减弱PCOS中卵巢组织的血管过度生成,从而缓解PCOS的发生与发展。