【摘 要】
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目的:牙周炎是由牙菌斑生物膜引起的牙周组织慢性感染性疾病,可引起牙周支持组织的破坏,导致炎症发生、牙周袋形成、进行性附着丧失和牙槽骨吸收,严重时甚至会导致牙齿松动脱落,是危害人类口腔健康的主要疾病之一。牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）和具核梭杆菌（F.nucleatum）在牙周炎的发生和发展中起着至关重要的作用。P.gingivalis是一种产黑色素革兰氏阴性厌氧菌,与齿垢密螺旋体和福赛
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81870771）； 中国博士后科学基金第12批特别资助（No.2019T120224）；
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目的:牙周炎是由牙菌斑生物膜引起的牙周组织慢性感染性疾病,可引起牙周支持组织的破坏,导致炎症发生、牙周袋形成、进行性附着丧失和牙槽骨吸收,严重时甚至会导致牙齿松动脱落,是危害人类口腔健康的主要疾病之一。牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）和具核梭杆菌（F.nucleatum）在牙周炎的发生和发展中起着至关重要的作用。P.gingivalis是一种产黑色素革兰氏阴性厌氧菌,与齿垢密螺旋体和福赛斯坦纳菌共同形成“红色复合体”,是牙周炎的主要病原体之一。它可通过侵袭进入宿主细胞,影响某些细胞因子的合成及分泌,调控细胞增殖、凋亡等生物学行为,从而发挥其致病作用。F.nucleatum作为一种长梭状的革兰氏阴性厌氧菌,在牙周炎患者口腔内大量检出,可作为“桥梁细菌”连接口腔内早期和晚期定植者,是一种重要的牙周致病菌。F.nucleatum表面大量黏附素的表达介导了重要的生物膜聚集行为以及对宿主细胞的黏附侵入。不同微生物种群之间的相互作用影响宿主疾病的发生和发展。因此,有必要探索不同病原菌的特性及其相互作用的毒力机制。作为两种口腔常见致病菌,P.gingivalis和F.nucleatum之间的相互作用逐渐引发关注。在P.gingivalis的生长过程中,直径约50-250纳米的双层球形膜状囊泡不断从细菌表面分泌,称为外膜囊泡（Outer membrane vesicles,OMVs）。由于囊泡膜结构的保护,高浓度的致病因子可以避免降解并实现长距离传递,使得P.gingivalis OMVs比细菌具有更强的毒性。因此,OMVs可能代表P.gingivalis与其他口腔细菌相互作用,并影响其他细菌的功能。目前已有一些体内外实验探究了P.gingivalis和F.nucleatum混合感染后对宿主造成的影响,然而关于其内在机制的报道较少。因此,本实验通过进一步建立P.gingivalis OMVs处理F.nucleatum的模型,探究P.gingivalis影响F.nucleatum侵入人永生化口腔上皮细胞（HIOECs）内在机制。研究方法:1.将P.gingivalis和F.nucleatum混合感染HIOECs,应用流式细胞术分别检测P.gingivalis和F.nucleatum的侵入率,以观察P.gingivalis和F.nucleatum混合感染对这两种细菌侵入HIOECs的能力是否存在影响。2.提取P.gingivalis OMVs,应用透射电子显微镜（TEM）和纳米粒径追踪分析（NTA）对其进行鉴定。建立热灭活前后P.gingivalis OMVs处理F.nucleatum的模型,采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测处理后的F.nucleatum侵入HIOECs的情况。3.通过扫描电子显微镜（SEM）观察F.nucleatum形态的变化,多功能酶标仪检测F.nucleatum增殖能力的变化。4.通过q RT-PCR和Western blot检测F.nucleatum表面黏附因子Fad A和Fom A的表达。5.通过光学显微镜观察F.nucleatum自聚集程度的变化。结果:1.P.gingivalis和F.nucleatum混合感染HIOECs后,P.gingivalis侵入率增高,F.nucleatum侵入率降低（P<0.05）。2.成功提取了P.gingivalis OMVs。与对照组相比,P.gingivalis OMVs可以引起F.nucleatum侵入率降低（P<0.05）,而经过热灭活处理的P.gingivalis OMVs不会引起上述改变。3.热灭活前后的P.gingivalis OMVs均未引起F.nucleatum形态和增殖能力改变。4.P.gingivalis OMVs可以使F.nucleatum表面黏附因子Fad A和Fom A的蛋白表达降低（P<0.05）,而经过热灭活处理的P.gingivalis OMVs不会引起上述改变。5.P.gingivalis OMVs能够使F.nucleatum自聚集程度降低,提示P.gingivalis OMVs降低了F.nucleatum的黏附能力,而经过热灭活处理的P.gingivalis OMVs不会引起上述改变。结论:P.gingivalis OMVs可以在不引起F.nucleatum形态和增殖能力的改变的前提下,引起F.nucleatum表面黏附因子Fad A和Fom A的蛋白表达降低,减弱F.nucleatum自聚集能力,从而抑制F.nucleatum侵入口腔上皮细胞。
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