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背景与目的Bcl-2基因家族根据结构及功能的不同可分为两大类:抑凋亡基因包括Bcl-2、Bcl-x1、Bcl-w、mcl-1等;促凋亡基因包括Bcl-xs、Bax、Bad、Bak、Hrk和Bim等。这两类物质相互结合、彼此抑制,往往由其数量的相对多少决定凋亡发生与否。在Bcl-2家族中Bcl-2蛋白是最早被发现,分离,目前为止研究得较为透彻的家族成员。研究表明,它定位于线粒体膜、内质网膜和核膜上,具有离子通道( ion channel )和停靠蛋白(docking protein)的双重功能,在介导细胞凋亡的途径中起关键作用。Bcl-2蛋白通过调控内质网Ca2 +参与的核内外物质转运及膜通透性转换(PT)来阻止细胞色素C从线粒体中释放,从而阻止了其与Apaf-1、procaspase-9的相互作用,最终抑制Caspase-9、Caspase-3引发的细胞凋亡级联反应过程。总之作为一种抗凋亡基因,Bcl-2可保护细胞免于病毒、氧化剂等刺激诱导的细胞凋亡。目前研究认为Bcl-2基因及其相关蛋白高表达抑制细胞凋亡是肿瘤发生和产生耐药现象的重要因素之一。因此利用RNAi技术,通过抑制Bcl-2基因的表达,达到促进肿瘤细胞凋亡的目的,是目前正积极探索的一条新的肿瘤治疗途径。RNAi是一种从低等生物到哺乳动物都有的保守的防御反应。双链RNA在细胞内被RNA酶Ⅲ( RibonuclaseⅢ, RNaseⅢ)酶切成约21~23nt的小片断干扰RNA (short interfering RNA, siRNA),进而形成siRNA-蛋白复合物,即RNA诱导沉默复合体( RNA-induced silencing complex, RISC)。RISC通过识别、降解具有同源序列的信使RNA(messenger ribonucleicacid, mRNA),最终导致特异性的基因表达沉默(gene silencing)[1]。本研究将凋亡抑制基因Bcl-2的siRNA转导入大肠癌细胞株中,与肿瘤细胞凋亡研究相结合,采用MTT法、免疫细胞化学、免疫印迹、RT-PCR等方法,应用体外细胞培养实验观测了Bcl-2-siRNA对人大肠癌细胞株Caco-2增殖凋亡的影响,并初步探讨了其可能的分子机制,为开辟Bcl-2介导的RNA干扰治疗大肠癌提供了实验基础。方法1.从人大肠癌细胞中提取总RNA,利用Bcl-2基因特异性引物经RT-PCR扩增Bcl-2cDNA 861-1174bp片段,RT-PCR和Western blot分析不同大肠癌细胞株中目的蛋白的表达。2.利用脂质体法将Bcl-2-siRNA转染至人大肠癌细胞Caco-2,RT-PCR和Western blot分析转染前后目的蛋白表达变化。3.MTT法检测Bcl-2-siRNA对Caco-2细胞生长和增殖的影响,并利用TUNEL实验观察细胞凋亡,Western blot检测细胞凋亡通路中Bcl-2下游信号分子及凋亡相关因子的变化。结果1.利用RT-PCR,Western blot技术从人大肠癌细胞系中筛选出Bcl-2表达阳性的细胞株Caco-2。2.利用脂质体转染技术,可以将Bcl-2-siRNA转染至人大肠癌细胞Caco-2,并经RT-PCR、Western blot方法证实Bcl-2-siRNA引起Bcl-2蛋白表达下调。3.与转染非特异siRNA组细胞(Caco-2/mock)和未转染组细胞Caco-2比较,Caco-2/Bcl-2-siRNA组细胞增殖无明显改变(P>0.05);但TUNEL实验观察细胞凋亡数明显增加(P<0.01); Western blot检测凋亡通路中Bcl-2下游分子Caspase-3表达量增多,说明细胞凋亡增加;细胞凋亡调控因子survivin表达量下降,与Bcl-2正相关。结论凋亡抑制基因Bcl-2的siRNA转导入大肠癌细胞株可以使Bcl-2蛋白表达下调,并引起细胞凋亡增加;初步对survivin、Caspase家族进行了检测,并探讨了其与Bcl-2相互作用可能的分子机制,为开辟Bcl-2、survivin介导的RNA干扰联合治疗大肠癌提供了实验基础。