原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）在我国以及世界范围内都是常见的恶性肿瘤之一。肝癌的发生率在所有恶性肿瘤中排第五位，而由HCC导致的死亡率在所有恶性肿瘤中居第三位。肝炎病毒尤其是乙型肝炎病毒（Hepatitis Bvirus, HBV）的感染是肝癌发生的最主要致病原因。而我国为病毒性肝炎（主要是乙型病毒性肝炎）高发地区，理所当然也成为了肝癌的高发地区。由于人口基数大，全世界半数左右的肝癌病人集中在我国，其致死率能占我国所有恶性肿瘤的第二位。目前外科手术切除仍然是可切除肝癌首选的主要根治性治疗方法。随着外科学技术的飞速发展，尤其是医学及生命科学在本世纪取得了长足的进步，在肝癌的治疗方面也同样已经取得了巨大的成就。然而即使有了这许多的进步，肝癌术后的无瘤生存率及总体生存率近20年来仍然没有明显的提高，临床肝癌的诊疗中依然存在的早期发现和诊断比较困难、术后复发率较高（术后5年复发率可达70%），缺乏有效的抗复发治疗方法，肝癌的综合治疗或药物治疗缺少有效的治疗靶点等问题.而且还有很大一部分患者发现时已为中期或晚期肝癌，介入栓塞化疗（Transcatheterarterial chemoembolization， TACE）以及近年来应用于临床的以索拉非尼（Sorafenib）为代表的分子靶向治疗药物，其治疗效果都欠佳，肿瘤细胞耐药性是导致这一现象的重要原因。性别决定基因盒9（Sex-determining Region Y box9，Sox9）作为最近研究较多的具有潜在干性的标志物，其在肝脏胚胎发育过程中对维持干细胞干性以及细胞表型的调控有重要意义。它的异常表达与许多疾病的发生密切相关，甚至在许多癌症的发生中也发挥了极其重要的作用。最近研究发现，Sox9可以作为肝脏受损后再生修复过程中肝脏再生细胞的重要标志物。并且Sox9的表达水平与肝癌的手术预后密切相关。为了探索Sox9作为肝癌干细胞的潜在标志物。其在肝癌发生发展中的作用，我们进行了进一步的研究。研究方法：首先我们通过qPCR及Western Blot的方法分别研究了mRNA水平和蛋白水平肝癌组织中Sox9的表达情况。通过肝癌组织表达谱芯片检测肝癌和正常肝组织Sox9及其他基因的差异表达情况。制作肝癌组织的组织芯片，用免疫组织化学或荧光定位及定量分析肝癌组织中Sox9的表达情况。在多种肝癌细胞系中检测Sox9表达情况。利用慢病毒构建干扰Sox9工具。进行裸鼠成瘤实验，观察干扰及过表达Sox9后裸鼠成瘤情况，以及在这两种情况下给予5-FU或索拉非尼对肿瘤生长的影响有无不同。进一步我们检测了给药后期肿瘤组织中耐药基因ABCG2的表达，同时也检测了Sox9的表达。为了研究敲减Sox9是否可引起ABCG2的下调，我们在感染干扰病毒后的3天和7天检测了细胞中ABCG2的蛋白表达情况。并探索了Sox9与ABCG2在空间位置上的关系，在肝癌组织中对Sox9和ABCG2进行了免疫荧光双标检测。最终为了研究Sox9敲减后引起的耐药性降低是由哪些机制引起的，我们检测了HuH7感染干扰病毒后3天和7天的全基因表达谱，筛选在两个时间点均发生改变的基因。另外由于Sox9在不同肝癌组织中的表达情况差异显著，我们又进一步检测了该基因启动子区1937-2096位置CpG岛的甲基化情况。研究结果：前期120张肝细胞癌的表达芯片结果提示三种干细胞标志（EpCAM，CD90，CD133）阳性组织与Sox9阳性一致程度较高。不同的肝癌组织Sox9的表达分布差别迥异，有些表现阴性表达，有些表现为弥漫低表达，有些表达局限胆管样结构，而有些表现为弥漫强阳性。肝癌组织与对应的癌旁组织表达量比较发现，有些高于癌旁，有些低于癌旁，有些无明显差别。在对组织芯片进行免疫组化染色之后，根据表达灰度值的平均密度将组织中Sox9的表达量设定为阴性-，阳性+，中度阳性++，强阳性+++四个等级，我们发现随着Sox9表达量等级越高，患者的预后越差。感染多个肝癌细胞系筛选有效Sox9干扰序列，可见Hep3B、HepG2和HuH7等不同细胞系均可达到80%以上的感染效率。为了检测干扰Sox9对化疗药物耐受的影响，我们将感染病毒两天的肝癌细胞消化传代接种于96孔板，同时将相应的化疗药物（索拉菲尼或5-Fu）加于培养基中，于1d、2d、3d、5d、7d和9d不同时间点进行MTT法检测。在增殖率曲线中我们可以发现，干扰Sox9组与空病毒组在前3天没有显著差异，在第5天干扰Sox9组的增殖率显著降低，而且在之后的时间点均低于对照组。敲减Sox9合并索拉非尼可显著抑制肝癌细胞生长。与索拉非尼组相比，5-Fu的加入对肝癌细胞的增殖有类似表现：干扰Sox9组与空病毒组在前3天没有显著差异，在第5天干扰Sox9组的增殖率显著降低，而且在之后的时间点均低于对照组。干扰Sox9后肿瘤细胞在体对索拉非尼的耐受性降低。给药组均可显著抑制肿瘤生长，而且空病毒+索拉非尼组在28天肿瘤又开始显著增大，提示部分耐药细胞开始扩增，但干扰Sox9+索拉菲尼组仍然受到显著抑制。索拉菲尼给药后Sox9与ABCG2的表达有明显改变，给药后期ABCG2和Sox9的阳性比例有所增加。敲减Sox9后可使ABCG2蛋白水平降低。在感染干扰病毒后，我们发现ABCG2在3天时有所下调，在7天时明显下调。并且敲减Sox9后SP群明显减少。我们在肝癌组织中对Sox9和ABCG2进行了免疫荧光双标检测，发现这两个基因确实在大部分细胞上共表达，而且这两个基因的表达分布有两种典型的分布特点，即两个基因均表达于肝细胞样的肝实质细胞，或表达于胆管样肝实质细胞。进一步通过检测了HuH7感染干扰病毒后3天和7天的全基因表达谱，筛选在两个时间点均发生改变的基因，并通过功能聚类发现，参与药物代谢类的基因和蛋白泛素化的基因均有多个基因发生了改变。但值得注意的是，芯片中并未检测到ABCG2的mRNA水平发生改变，因此排除了Sox9在转录水平上调控ABCG2表达的可能。甲基化实验发现检测到的5个正常组织全部处于甲基化状态，而检测到的5个肿瘤组织中有一个是处于去甲基化状态。研究结论：Sox9在肝癌组织中差异表达，其表达水平与肝癌的恶性生物学行为及肝癌手术预后密切相关。通过细胞学及动物实验证实Sox9可以明显影响肿瘤细胞对5-FU及索拉非尼的耐药性。其具体作用机制可能与Sox9通过泛素化调控ABCG2表达水平密切相关。