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目的:近年研究表明纳米金能够阻止具有肝素结合位点的VEGF165与其受体VEGFR-2的结合,并抑制VEGF165的信号传导。本实验利用纳米金的这种新特性,研究纳米金能否抑制血管内皮细胞增殖并抑制裸鼠肝癌血管生成。以往研究认为白介素12(IL-12)通过诱导干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-γ诱导蛋白-10(IP-10)和干扰素-γ诱导单核因子(MIG)的生成,进而抑制肿瘤血管生成。然而,VEGF和Ang-2(血管生成素-2)是目前已知血管内皮细胞增殖的主要促进因子,我们推测IL-12是通过抑制肝癌组织中VEGF和Ang-2基因的表达,抑制血管内皮细胞增殖,发挥其抑制肝癌的血管生成和肝癌生长的作用。这种推测需要用实验加以证实。方法:1.用免疫印迹方法检测纳米金是否能特异性的与bFGF肝素结合位点结合;用纳米金与血管内皮细胞作用,检测细胞下游信号PLC—γ1的变化;用缺乏肝素结合位点的VEGF121作为对照,观察纳米金对血管内皮细胞增殖的影响;用AFM表征纳米金与VEGF165、VEGF121作用前后形貌大小变化,以及纳米金与血管内皮细胞作用前后细胞超微结构变化。将H22肝癌接种到Balb/c裸鼠,用或不用纳米金处理作为治疗组和对照组。用免疫组化方法检测肝癌微血管密度。测量肝癌大小、重量。2.构建含小鼠白介素12(mIL-12)双亚基基因的重组腺病毒(AdvmIL-12),检测重组腺病毒对H22肝癌细胞的感染效率。用ELISA法测定H22细胞中mIL-12蛋白的表达量;观察AdvmIL-12对H22细胞生长的影响。将AdvmIL-12转染的肝癌H22细胞作为实验组,以Adv-EGFP/H22为载体对照组和H22为空白对照组。这些细胞被分批接种到裸鼠肾包膜下,右前肢皮下。用RT-PCR法检测肝癌组织中的VEGF和Ang-2基因的表达;免疫组织化学方法测量肿瘤组织中微血管密度。测量肿瘤大小和重量。比较组间差别,P<0.05为有显著性差异。结果:1.体外实验表明,纳米金能够与具有肝素结合位点的bFGF结合;抑制VEGF165的信号传导;明显抑制VEGF165促进血管内皮细胞增殖作用。而纳米金对缺乏肝素结合位点的VEGF121没有抑制作用。2.裸鼠体内实验发现,用纳米金处理的实验组微血管密度为14.27±1.08,对照组微血管密度为23.52±1.36,实验组微血管密度较对照组明显减少(t=21.694,P<0.01)。实验组肿瘤体积较小,重量较轻,与对照组比较有显著性差异,P<0.05。3.在近生理条件下,AFM检测到纳米金与VEGF165、VEGF121作用前后血管内皮细胞超微结构变化。当血管内皮细胞处于增殖状态时,细胞表面出现许多大小约数百纳米的颗粒,细胞膜边缘明显延伸,伪足明显延长。相反地,当血管内皮细胞被纳米金抑制时,细胞表面颗粒大为减少,伪足缩短。4.在AdvmIL-12感染复数为100、感染时间为2小时情况下,重组腺病毒的转染率为96.41%。实验组细胞上清液中检测到IL-12蛋白的表达量为(89.71±22.05)ng.48h-1.106 cells-1。AdvmIL-12对H22细胞的生长无抑制作用。5.裸鼠体内实验表明,实验组肝癌组织中IL-12蛋白的表达量明显高于对照组,而实验组VEGF和Ang-2基因的表达弱于对照组。VEGF基因比值分别为:实验组0.8867±0.1924,载体对照组1.1744±0.1189,空白对照组1.1874±0.1752,P<0.05。Ang-2基因比值分别为:实验组0.7878±0.1471,载体对照组1.0319±0.1574,空白对照组1.0361±0.1536,P<0.05。实验组肿瘤平均重量、肿瘤体积和肿瘤微血管密度明显少于对照组,差异有显著性。结论:1.体外实验表明,纳米金能够抑制VEGF165的信号传导,明显抑制VEGF165促进血管内皮细胞增殖作用。而纳米金对缺乏肝素结合位点的VEGF121没有抑制作用。2.在裸鼠体内,纳米金通过阻止VEGF165与VEGFR-2结合,抑制H22肝癌血管生成和肝癌生长。3.AFM探测结果表明,纳米金抑制了VEGF165促血管内皮细胞增殖的作用。4.AdvmIL-12高效感染H22细胞,对体外培养H22细胞的生长无抑制作用。5.在缺乏T细胞的裸鼠体内,IL-12通过抑制肝癌组织中VEGF和Ang-2基因的表达,并抑制血管内皮细胞增殖,发挥其抑制H22肝癌血管生成和肝癌生长的作用。本实验结果将有助于肝癌及其他实体肿瘤的抗血管生成治疗。