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目的本实验旨在利用突触水平上反映学习记忆的理想模型---长时程增强(long term potentiation LTP)及行为学的方法论证不同水平的高胆红素血症对大鼠中枢神经系统近、远期的影响,同时结合形态学的定量定性指标,进一步探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor bFGF)在胆红素源性脑损伤方面的治疗作用,以期改善临床病例的远期预后。方法 ⑴ 模型建立:1周龄健康Wister大鼠随机分成对照组(CG)、实验1组(T1G)、实验2组(T2G)及治疗组(BTG)。T1G、T2G和BTG大鼠腹腔内注射不同浓度胆红素溶液以建立高胆红素血症模型。重氮反应法测定血及海马外脑组织胆红素浓度,同时光镜观察脑片确定模型建立的成功。⑵ bFGF治疗方法:治疗组大鼠于模型制作后30min、1d、3d、5d、7d分别经腹腔注射bFGF, 6IU/g.次,对照组注射等量磷酸盐缓冲溶液。⑶ 形态学检测:2d、8d、28d、60d分批处死大鼠,海马组织分别用福尔马林、4%多聚甲醛和戊二醛固定,分送光镜观察胆红素颗粒在脑组织的沉积,硫堇染色观察尼氏体数量形态、免疫组化测量GAP-43阳性神经元光密度值观察功能性再生的程度,另有部分送检电镜。⑷ 行为学测试:按照经典Morris水迷宫法测试定位航行试验 (place navigation test PNT)及空间探索实验(spatial probe test SPT)。分别记录大鼠的逃避潜伏期(escape latency EL),各象限的游泳距离及其所占百分比、跨平台相应位置的次数及比例,同时观察大鼠搜索平台路线图的特征。⑸ 神经电生理学--LTP:单笼饲养至60d龄大鼠,成功埋植电极后,LTP激发装置自动记录单脉冲刺激下的群峰电位(population spike PS) 及高频串刺激(high frequency stimulation HFS)诱发LTP,观察PS幅值的变化。 结果 1. 动物模型的鉴定:(1) 大鼠活体观察:T1G少数有呼吸增快、烦躁;T2G普遍<WP=9>反应低下,异常神经体征多见,提尾抬头反射罕见,死亡例数多;CG未见异常。(2) 脑标本大体观察:CG及T1G均无肉眼可见异常,T2G可见海马区、小脑、基底核部位散在深浅不一黄染区。光镜下脑片仅 T2G可见散在胆红素颗粒沉积。(3) 胆红素浓度:T1G及T2G的血清及脑组织胆红素浓度均明显高于CG,以T2G更明显,指标差异有显著性或极显著性(P<0.01或P<0.001)。2. 形态学指标:(1) GAP-43: T1G及T2G中GLIN均较CG明显增多,神经元突起网络明显(T1G:P<0.05;T2G: P<0.01),T2G变化明显高于T1G。(2) 尼氏体:CG海马区尼氏体数量稳定;实验第2d,T1G、 T2G尼氏体开始出现脱失,第28d尼氏体数目降至最低,统计学差异明显(P<0.05、P<0.01 );T2G尚可见噬神经细胞现象。(3) 电镜:T1G出现少量异染色质及异常管网结构;脱髓鞘样变性多见。T2G全视野下神经细胞膜皱缩、破裂,高密度脂褐素样物质沉积多见;髓鞘样变性、神经水肿严重;小胶质细胞、少突胶质细胞异常活跃。3. 学习记忆检测:(1) Morris水迷宫:T2G及T1G的潜伏期与CG相比均明显延长(P<0.01)。CG、T1G大鼠在原平台象限泳距占总泳距的百分比均为各自相应比例中的最高,跨原平台次数比例高达80.2%和76.11%,提示T1G记忆能力未受明显损伤,而T2G大鼠运动轨迹呈“远离平台周边型”,统计显示各象限无显著差别(P>0.05),其跨原平台或平台相应位置的总次数也明显降低。(2) LTP测定:实验动物总数的95%成功诱发LTP。单脉冲刺激所诱发的PS平均幅值组间无显著差异。高频刺激诱发的达标LTP平均幅值,其中CG增加到217.43%±35.21%,T1G、T2G则只增强到176.29%±14.55%和144.36%±11.72%,统计学差异明显(P<0.05)。4. bFGF治疗效果:治疗组同时段GAP-43表达水平较未治疗组增加,神经网络形成更加明显;尼氏体数量也在实验第28d全面表现出有统计学差异的增多。电镜下治疗组神经细胞膜完整、饱满,脂褐素样物质不明显,肿胀程度有明显减轻。水迷宫实验中,BTG的平均潜伏期下降至48.7±4.8s,跨越平台的总次数也明显增加;bFGF的治疗还使治疗组LTP的幅差平均增加13.9%,与未治疗组相比差异明显(以上各项指标均为P<0.05或P<0.01)。但治疗组的各项指标改善的程度较正常对照组仍有明显的差异。结论1.高胆红素血症可以造成实验动物神经系统的肯定性损伤,其损伤病理学基础是病变区(本实验中为海马部位)神经细胞数量的减少和正常形态的破坏。 <WP=10>2.高胆红素血症可以减低模型动物远期的学习记忆能力,电生理指标改变显著,提示高胆红素状态下的神经细胞数量的减少和突触功能的丧失不能靠机体自身完全修复。3.相对“安全”的血清胆红素水平仍然可以造成神经系统显著的近/远期损害,临床评估并不总能可靠判断预后,积极而适当的干预十分必要。4.bFGF对胆红素源性脑损伤有可靠的治疗作用,近/远期各项指标改善明显,但单纯的bFGF治疗作用有限。