大肠杆菌可引起人胃肠道感染、关节炎、以及败血症等疾病,严重危害人体健康。传统检测大肠杆菌方法存在耗时长,易污染、成本高或操作专业性强等问题。近年来,具备辣根过氧化物活性的脱氧核酶因合成简单、成本低、活性稳定等优势,在生物传感领域备受关注。然而,现阶段基于脱氧核酶的生物传感器均存在脱氧核酶活性低,检测背景值高等问题。经研究发现,脱氧核酶邻近碱基对可对核酶活性进行调整。基于此,本文以大肠杆菌为检测靶标,构建了两种基于邻近碱基对活性调控的脱氧核酶生物传感器用于大肠杆菌检测。结果表明,上述传感器具有简易快速、低成本、高灵敏度、高特异性等优势,为大肠杆菌检测提供了新思路。本文研究内容如下:一、邻近碱基对抑制型脱氧核酶生物传感器的构建及其应用:通过改变G4（G-四链体）尾端邻位的碱基对种类,形成4种脱氧核酶类型。当碱基对为A:T（腺嘌呤与胸腺嘧啶杂交）时,能显著降低G4脱氧核酶原有的催化活性,活性抑制倍数高达17倍,该发现称为邻近碱基对抑制脱氧核酶活性现象。随后,验证了该现象在多种缓冲液、较宽pH范围、多种反应底物中的普适性。采用分子动力学模拟、腺嘌呤类似物等进行机制分析,提出该现象产生的可能性:互补碱基六原子环上的羰基起重要作用。该现象保留了 G4原有结构,基于该现象构建的传感器具有实时分析能力。本章基于上述现象,结合大肠杆菌适配体构建了邻近碱基对抑制型脱氧核酶传感器检测大肠杆菌,通过特异性检测、工作曲线、加标实验等方面探究该传感器的工作性能。实验结果表明,该传感器在2 × 102-2 × 106 CFU/mL呈现良好的线性关系,检测限为21CFU/mL,且具有良好的特异性。二、邻近碱基对增强型脱氧核酶生物传感器的构建及其应用:结合以上研究思路,改变G4尾端邻近第一位碱基和第二位的碱基对种类,形成16种脱氧核酶类型。发现G4尾端碱基对为AA:T（第一位碱基为A,第二位碱基对为A:T）的脱氧核酶活性较原始脱氧核酶活性提高至3倍,该发现称为邻近碱基对增强脱氧核酶活性效应,G4-AG:C同样存在该效应。随后验证了该现象在不同缓冲液、pH、反应底物体系中的普适性。此外,腺嘌呤类似物均能产生该现象。紫外光谱表明该现象保留脱氧核酶原有结构。将该现象与大肠杆菌适配体结合,构建了增强型生物传感器应用于大肠杆菌检测,并通过特异性、检测范围、检测限多方面验证了该传感器具备良好的检测性能。实验结果表明,该传感器在2×102-2×107 CFU/mL呈现良好的线性关系,检测限为16CFU/mL。