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Bcl-2蛋白在其结构松散的loop区会发生多位点磷酸化修饰,其重要意义仍然存在争议,有可能是缺少对于磷酸化Bcl-2结构生物学的研究。最近研究表明高表达磷酸化Bcl-2蛋白的细胞系对获得FDA认证的Bcl-2抑制剂Venetoclax(ABT-199)产生耐药性,同时对于ABT一系列的药物包括ABT-737和ABT-263在许多癌症中也存在耐药性。对于磷酸化Bcl-2的结构研究将有助于我们理解磷酸化修饰的Bcl-2蛋白如何调节细胞凋亡,并且可以解释为何目前基于Bcl-2蛋白表面BH3沟槽设计的BH3模拟物小分子对于磷酸化Bcl-2会产生耐药性。然而,由于Bcl-2结构特点带有松散无结构的loop区,对溶液稳定性有影响,所以无法获得大量稳定的蛋白,导致磷酸化Bcl-2的结构生物学研究受到阻碍。之前的工作研究是用结构修饰的Bcl-2/Bcl-xL嵌合体,然而T69,S70,和S87磷酸化位点都被忽视了。我们构建一个模拟磷酸化的突变体Bcl-2(2-206)(t69e,s70e和s87e)(EEE-Bcl-2(2-206)),即将磷酸化位点t69,s70,和s87突变成谷氨酸来模拟磷酸化的电荷,并将C末端氨基酸切除,进而提高溶液的稳定性。为了进一步得到大量可溶、稳定和满足核磁谱图需要的蛋白,我们构建了模拟磷酸化突变体Bcl-2(62-206)(t69e,s70e和s87e)(EEE-Bcl-2-EK),此突变体磷酸化位点突变成谷氨酸,保留磷酸化位点的前提下删除BH4域和部分loop区(2-61的氨基酸残基)。实验结果表明,重组突变的EEE-Bcl-2-EK蛋白与天然的磷酸化Bcl-2蛋白在体外和活体肿瘤细胞内其生物学活性和功能活性具有一致性,并与Bcl-2蛋白有些不同。二维核磁谱图中发现EEE-Bcl-2-EK与Bcl-2蛋白的BH3沟槽有些不同,表明loop区的磷酸化诱导活性功能域结构发生改变,这也解释磷酸化调节Bcl-2蛋白的抗凋亡活性原因。