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酚类化合物是一类具有芳香环羟基结构的化合物,广泛存在于自然界中,如存在于水果、蔬菜、豆类、谷物、茶及中药植物中,具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、消炎、防治心脑血管疾病等多种生理学和药理学功能,因而被广泛关注和深入研究。但有的酚类化合物具有一定的毒性和低水溶性,在一定程度上限制了其在医药、保健品、化妆品等行业的应用。糖基化修饰酚类化合物不仅能改善其水溶性和稳定性,减少其对人体的刺激性和毒副作用,还是开发药物的新途径之一。酶法糖基化具有立体选择性和区域选择性的特点,能催化糖基供体和糖基受体一步合成特定糖苷产物,并且反应条件温和、环境友好。β-半乳糖苷酶是一类可用于半乳糖基修饰的重要糖苷酶,但该类酶糖基化的酚类受体有限,且转酚效率较低。本论文通过分子改造保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)L3 β-半乳糖苷酶,提高了该酶转酚的效率,并且拓宽了转糖基受体选择性,合成了一系列新的酚类半乳糖苷化合物。该研究为酶法糖基化酚类化合物提供了新的工具酶,所获得的新的糖苷化合物在医药方面具有潜在的应用价值。首先对 L.bulgaricus L3 β-半乳糖苷酶 BgaL3(GenBank No.ACE06986.1)进行3D结构模拟,发现W980位点位于活性中心的入口处,参与了酶与底物最初的叠加作用,可能与酶的底物选择性相关。以前期工作构建的带有该酶基因的重组质粒pET-21b-bgaL3为模板,对W980位点进行点饱和突变,所获得的19种突变酶与原始酶相比对邻硝基苯-β-半乳糖(oNP-β-Gal)的水解活性大幅度降低,同时对乳糖的转糖基能力也降低。但当以乳糖为糖基供体、对苯二酚为糖基受体进行转糖基反应时,突变酶W980F乳糖自转能力仍然较低,但转酚能力提高。另外对突变酶W980F的供体底物特异性进行研究,发现该酶还能水解pNP-β-岩藻糖苷,并且具有转岩藻糖基活性,以pNP-β-D-岩藻糖苷为底物自转合成产物pNP-β-D-Fuc-(1→3)-β-D-Fuc。进一步研究了突变酶W980F对多种酚类及其他化合物的转糖基活性,如苯酚、邻苯二酚、间苯三酚、焦性没食子酸、没食子酸、咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、槲皮素、芦丁、丁香酸、绿原酸、紫杉醇。BgaL3和W980F都能糖基化苯酚、对苯二酚、邻苯二酚、间苯三酚,W980F转糖基产物产量较原始酶提高了7.6%-53.1%;W980F能以原始酶不能利用的焦性没食子酸和咖啡酸为糖基供体进行转苷反应,产量分别为32.3%和7%;BgaL3和W980F对没食子酸、槲皮素、芦丁、丁香酸、绿原酸、紫杉醇均未检测到转糖基活性。应用突变酶W980F以200mM乳糖为糖基供体、分别以100mM苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、焦性没食子酸、咖啡酸为受体建立转糖基反应,反应温度45℃C,反应时间45min,采用Bio-gel-P2和制备型HPLC对产物进行分离纯化,并通过质谱(MS)和核磁共振(NMR)对产物的结构进行鉴定,所得糖苷产物结构分别鉴定为苯酚-O-β-半乳糖苷、对苯二酚-O-β-半乳糖苷、邻苯二酚-O-β-半乳糖苷、焦性没食子酸-1-O-β-半乳糖苷、焦性没食子酸-2-O-β-半乳糖苷、咖啡酸-3-O-β-半乳糖苷、咖啡酸-4-O-β-半乳糖苷。在定点突变工作开展的同时,采用易错PCR对L.Bulgaricus L3的β-半乳糖苷酶基因bgaL3进行随机突变,经过X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)平板水解活性的初筛和以白藜芦醇为受体的转苷活性复筛,最终筛选到一株突变酶252,能糖基化白藜芦醇。对突变酶252进行基因测序并与BgaL3比对发现,252存在6个氨基酸位点突变,分别为Q40R、K85R、F177S、D433G、V511A、E707G,分别对6个位点进行单点突变后,发现突变酶F177S、D433G、V511A、E707G具有白藜芦醇转苷活性,而突变酶Q40R、K85R未检测到白藜芦醇转苷活性。应用突变酶252以200 mM的乳糖,44μM的白藜芦醇,45 ℃C反应30 min的转苷反应中生成新的糖苷产物。通过乙酸乙酯萃取目标产物,将其与乳糖及乳糖自转产物初步分离,再进一步经TLC和高效液相色谱HPLC分离纯化后,MS分析检测到特征分子离子峰[M+Na]+413.1,证实突变酶252催化合成的糖苷产物为白藜芦醇单糖苷(Mr 390),经核磁氢谱结果推测糖苷键的类型为β型,为两种同分异构体的混合物,推测结构为白藜芦醇-3-O-β-半乳糖苷和白藜芦醇-4’-O-β-半乳糖苷。目前对白藜芦醇糖苷产物的分离纯化和结构确证工作还在进行中。