目的:1.免疫组化法、免疫荧光染色检测头皮中具有多能性基因的细胞分布。并且分离毛乳头,进行免疫荧光染色。2.通过流式细胞分选仪(Fluorescence-activated cell sorter,FACS)分选人头皮真皮成纤维细胞中抗SSEA3抗体阳性的细胞,获得应激耐受多系分化细胞(multilineage-differentiating stress-enduring cell),即Muse细胞,进行多能性鉴定。3.检测Muse细胞分化为黑素细胞、成骨细胞、肝细胞的能力,检测Muse细胞培养液对成纤维细胞增殖的影响,探讨可能的原因。方法:1.获取正常成年人的头皮标本,常规石蜡切片,进行SSEA3、Oct4、Sox2、Nanog、nestin免疫组化染色;同时对头皮标本进行冰冻切片,采用SSEA3和CD34免疫荧光染色。对体外培养的人毛乳头细胞进行SSEA3、CD34、α-SMA免疫荧光染色。2.采用FACS,从培养的头皮来源的真皮成纤维细胞,分选出抗SSEA-3抗体阳性的细胞(Muse细胞);进行碱性磷酸酶染色,用免疫荧光染色、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)及Western-blot检测其多能性。用携带Oct4、Klf4、c-Myc、Sox2的慢病毒转染Muse细胞,获得诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)样克隆。3.通过添加不同的培养成份,诱导Muse细胞分别分化为:黑素细胞、成骨细胞、肝细胞。CCK8试剂盒检测Muse细胞的培养液对成纤维细胞的增殖影响。RT-PCR检测Muse细胞HGF、IGF基因的mRNA表达。结果:1.免疫组化染色结果显示:在正常人的头皮标本中,SSEA3阳性细胞分布于小汗腺、血管内皮、皮脂腺、毛乳头、外毛根鞘;少量Oct4阳性细胞分布于外毛根鞘、小汗腺、血管内皮;少数Sox2阳性细胞分布于小汗腺、毛乳头及外毛根鞘;少量nestin阳性细胞分布在小汗腺、血管内皮、生长期毛乳头中;Nanog染色显示阴性。免疫荧光染色结果显示:SSEA3分布在小汗腺、外毛根鞘、毛乳头,CD34主要分布在外毛根鞘、毛乳头。部分体外培养的人毛乳头细胞表达SSEA3、CD34。2.用FACS成功分选出SSEA-3阳性细胞(Muse细胞)。将分选出的细胞在2-羟乙基甲基丙烯酸脂(2-hydroxethyl methacrylate,Poly-HEMA)包被板中培养,采用甲基纤维素(Methylcellulose,MC)培养基,使之能悬浮生长,经过7~10天的生长,细胞成簇(Muse细胞簇),且直径达到最大。为了进一步扩增细胞,将悬浮生长的Muse细胞簇进行贴壁培养,可见细胞簇周边细胞放射状生长,光学显微镜下,细胞呈纺锤形。扩增后的Muse细胞再次悬浮培养,获得新Muse细胞簇,如此循环几次,获得大量的Muse细胞,用于多能性检测和诱导分化的研究。Muse细胞/Muse细胞簇对碱性磷酸酶染色显示阳性,即细胞呈紫红色,在细胞簇中央,染色更深。SSEA-3、Nanog、Sox2、Oct4阳性表达。经携带Oct4、Klf4、c-Myc、Sox2的慢病毒转染Muse细胞,获得iPSC样克隆,该克隆在荧光显微镜下呈现为绿色团块,表明转染成功。Muse细胞转染为iPSC的效率约为0.03%,高于亲本成纤维细胞(fibroblast cell,FC)的转染效率。RT-PCR结果显示:在Muse细胞以及Muse细胞形成的iPSC中,Oct4、Sox2、Nanog、hKlf4的基因表达均显著高于亲本成纤维细胞。并且,iPSC的Sox2、Oct4、hKlf4基因表达也比Muse细胞的高。Western-blot结果显示:Muse细胞及i PSC的Sox2、Oct4、Nanog蛋白的表达量高于亲本FC。3.体外诱导Muse细胞可分化为黑素细胞,并经HMB45、TYR免疫荧光染色证实。同时,将Muse细胞诱导分化为成骨细胞、肝细胞,诱导后细胞均进行特异性标记的免疫荧光鉴定证实。培养Muse细胞3天的培养液,以1:1的比例添加到FC培养基中,促进FC的增殖。结论:1.正常人头皮组织的免疫组化及免疫荧光检测显示:表达多能性因子的细胞集中于毛乳头、外毛根鞘、血管内皮、小汗腺等部位。部分体外培养的毛乳头细胞表达CD34和SSEA3。2.原代培养的头皮来源的真皮成纤维细胞,经FACS可以获得SSEA-3阳性的Muse细胞,这些细胞具有多能性及自我更新能力,转染Muse细胞为iPSC的效率比亲本FC高。3.Muse细胞可以诱导分化为黑素细胞、成骨细胞、肝细胞。Muse细胞培养液可以促进体外培养的FC增殖。