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研究背景： celecoxib是第一个进入临床的选择性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制剂，由于其能选择性作用于COX-2，对正常表达的COX-1无明显影响。因此，与传统的非甾体类抗炎药(Non-steroidalanti-inflammatory drugs，NSAIDs)相比，对胃肠道、血液、肾脏的毒性大大降低，目前已被广泛应用于慢性炎症性疼痛的治疗。近年来研究发现，celecoxib具有一定的抗肿瘤活性，在体外实验中可以抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导凋亡；在大鼠结肠息肉模型中可以有效降低息肉的数量和体积。目前，celecoxib已被FDA批准用于家族性多发性肠息肉病(FAP)的防治，但有关celecoxib对肝癌细胞的作用及其抗肝癌效应知之甚少。本文进行了celecoxib对肝癌细胞株体外作用的实验研究，旨在探讨celecoxib抗肝癌效应及其作用机制。 研究目的： 1．观察COX-2 mRNA及蛋白在HepG2、BEL-7402、SMMC-7721三种肝细胞癌细胞株中的表达情况。 2．观察celecoxib在体外对三种细胞株抑制增殖、诱导凋亡的生物学效应。 3．探讨celecoxib抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡可能的分子机制。 研究方法： 1．细胞培养：选用HepG2、BEL-7402、SMMC-7721三种肝细胞癌细 南京医科大学硕士学位论文 胞株为celeCoxib体外作用的模型，按常规方法培养。 2.应用原位杂交技术检测三种肝癌细胞株中Cox一2 mRNA表达; W亡Stem Blot方法检测COX一2蛋白表达水平;免疫细胞化学实验对 COX一2蛋白表达进行定位。 3.倒置显微镜和常规HE切片观察Celecoxib对三种细胞株生长的影响。 4.MTT法检测cetecoxib处理后细胞增殖抑制率的变化。 5.免疫细胞化学检测用药前后PcNA表达和Akt(Thr，08)磷酸化水平的 改变。 6.流式细胞术和TtJNEL实验检测细胞凋亡指数。 7.western Blot实验检坝，J用药前后caspase一9、caspase一3激活水平， Akt(Thr，08)磷酸化水平的改变。 8.免疫细胞化学及TUNEL实验结果使用Leica RAZ型图像分析系统进 行处理。研究结果: 1.原位杂交结果显示三种肝细胞癌细胞株中均可以检测到COX一2mRNA表达，Westem Blot结果显示三种肝细胞癌细胞株中均可以检测到COX一2蛋白的表达，免疫细胞化学结果显示COX一2蛋白主要定位于细胞浆。 2.倒置显微镜下观察，celecoxib呈剂量和时间性依赖性地抑制三种肝细胞癌细胞株的增殖，光镜观察，细胞出现凋亡现象，有凋亡小体形成。 3.MTT法显示celecoxib可明显抑制三种肝细胞癌细胞株的增殖，这种抑制效应在6.25林mol几即可出现，且与药物浓度和作用时间正相关。 南京医科大学硕士学位论文 4.流式细胞术分析显示，celecoxib作用24小时可明显诱导SMMC一7721细胞发生凋亡，细胞凋亡率与药物浓度正相关。对照组、6.25林mol/L、1 2.5林mol/L、25林mol几、50林mol/L所诱导的细胞凋亡率分另，J为0 .81%、4.84%、16.10%、22.80%和33.80%。 5.TU勺EL实验结果显示，三种肝癌细胞株的凋亡指数随celecoxib浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增加，50林mol几作用24小时可诱导BEL一7402、sMMe一7721、HepGZ细胞株发生凋亡，凋亡指数分别为26.40土3.05%、30.60士2.89%和25.01士3.08%。 6.免疫细胞化学结果显示，Celecoxib作用24，J、时后PCNA的表达和Akt(Thrs08)的磷酸化水平均受到明显抑制。 7.western Blot结果显示，eeleeoxib处理24，J、时后easpase一9、easpase一3被明显激活，激活程度与药物浓度和作用时间相关;celecoxib处理4，卜时Akt(Thr，0‘)的磷酸化水平也受到明显抑制。研究结论: 1.三种肝细胞癌细胞株中均有COX一2 mRNA和COX一2蛋白表达。 2.celecoxib在体外可明显抑制三种肝细胞癌细胞株增殖，并可诱导细胞发生凋亡，该效应呈剂量和作用时间依赖性。 3.。elecoxib抑制细胞增殖可能与下调PCNA的表达有关。 4.eeleeoxib可能通过持续抑制Akt(Thr，08)的磷酸化，进而激活easpase一9、easpase一3，从而诱导细胞发生凋亡。