胶体金免疫层析法具有检测速度快(5-15 min)、抗溶液基质干扰能力强、操作简单等优点,是现场快速筛查的首选方法。但该方法目前基本采用目测进行定性分析,因此检测灵敏度不高,人为因素干扰大。本研究探讨采用一种新型的二氧化硅荧光纳米微球为标记物并将其应用于免疫层析试纸条快速检测方法的建立,同时建立了基于T/C比值法荧光微球免疫层析试纸条定量检测模型,为免疫层析试纸条的快速定量分析提供了科学依据,并拓延了普通免疫层析试纸条的应用范围。本研究中的荧光微球通过有机硅源水解掺杂Ru(4,7-Ph2-phen)3合成获得。荧光微球最大激发波长450 nm,最大发射波长570 nm；经透射电子显微镜测定荧光微球直径为77nm±6 nm;纳米粒度仪及Zeta电位分析仪测得其平均水动力学直径约为240 nm, pH 5.0时测得Zeta电位为-25.34 mV,抗体最大标记量为120μg/mg。荧光微球在pH 4-10,盐离子浓度低于1 mol/L的条件下具有较好的荧光稳定性。以小分子盐酸克伦特罗抗原(CLE)以及抗盐酸克伦特罗单克隆抗体为研究对象,成功研制了基于荧光微球标记的CLE免疫层析试纸条。CLE荧光微球免疫层析试纸条的生产工艺条件如下：每毫克荧光微球抗体标记量为30μg；荧光微球抗体偶联物的封闭条件为：以0.02mol/L PB为溶剂,1%BSA为封闭剂;结合垫上荧光微球喷涂量为5 μg/cm,结合垫的干燥方式为30℃真空干燥；NC膜上T线喷涂CLE-BSA抗原浓度为0.5mg/mL, C线喷涂驴抗鼠二抗浓度为1.0mg/mL。以该试纸条分析了T、C线抗原抗体免疫动力学反应。结果显示,T、C线荧光强度随反应时间延长而增加,在加样大约30-40 min后,荧光强度趋于稳定,但观测T/C比值在5-10 min后即可进入平衡,表明T/C比值法可消除免疫反应动力学的差异。在此基础上建立了基于T/C比值法的CLE荧光微球免疫层析试纸条定量检测模型。该免疫层析试纸条免疫竞争抑制曲线符合免疫学反应规律,该曲线线性方程为y=-0.2607Ln(x)+0.5936,回归系数R2=0.9957,定量检测范围为0.3-5ng/mL,试纸条IC5o为1.43 ng/mL (N=5),尿样中最低检测灵敏度为0.27 ng/mL;该试纸条与沙丁胺醇交叉反应率为0.2%,与莱克多巴胺、塞曼特罗、西布特罗、特布他林等结构类似物交叉反应率小于0.01%。试纸条检测CLE阳性添加样品的回收率在97.7%-114.5%之间,同一批次试纸条批内检测变异系数为10.4%-16.8%,批间检测时间的变异系数为12.4%-14.2%,表明该试纸条具有较好的准确度和精密度。将CLE荧光微球试纸条定量分析50个实际猪尿样本的检测结果与商品化ELISA试剂盒检测结果进行相关性分析,结果表明两种方法具有较好的相关性(R2=0.9792)。以上实验说明基于T/C比值法建立的CLE荧光微球免疫层析试纸条定量检测模型可用于实际猪尿中CLE残留的定量分析。进一步以小分子恩诺沙星抗原(ENR)以及抗恩诺沙星单克隆抗体为对象,研制了基于荧光微球标记的ENR免疫层析试纸条。ENR荧光微球免疫层析试纸条的生产工艺条件如下：每毫克荧光微球抗体标记量为20 pg；结合垫上荧光微球喷涂量为4 μg/cm; NC膜上T线喷涂ENR-BSA抗原浓度为1.2 mg/mL,C线喷涂驴抗鼠二抗浓度为1.0 mg/mL。以该试纸条探讨了NC膜上喷涂T线在前或C线在前对荧光微球试纸条抗原抗体反应动力学、检测灵敏度以及定量分析的影响,实验结果表明NC膜上喷涂C线在前,ENR荧光微球免疫层析试纸条检测灵敏度较T线在前偏低；抗原抗体反应动力学结果显示,C线在前T/C比值进入稳定期时间约为10-20 min,而T线在前T/C比值进入稳定期时间约为5-10 min。以NC膜喷涂T线在前模式建立了ENR荧光微球试纸条定量检测曲线,结果表明该免疫层析试纸条竞争抑制曲线同样符合免疫学反应规律,该曲线线性方程为y=-40.683Ln(x)+55.926,回归系数R2=0.9907,定量检测范围为0.5-2.5 ng/mL,试纸条ICso为1.2 ng/mL(N=5)；该试纸条与环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星交叉反应率小于6%,与依诺沙星、达氟沙星、洛美沙星交叉反应率小于0.01%；试纸条检测ENR阳性添加样品的回收率在92.4%-107.9%之间,同一批次试纸条批内检测变异系数为7.9%-15.6%,批间检测时间的变异系数为9.6%-13.4%,表明该试纸条具有较好的准确度和精密度。总之,本研究成功建立了定量检测盐酸克伦特罗以及恩诺沙星的荧光微球免疫层析试纸条方法,通过实际样品分析盐酸克伦特罗荧光微球试纸条定量分析结果与相应的ELISA试剂盒具有较好的相关性。