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MicroRNAs (miRNAs)是一组内源性非编码的小RNA分子,由19-22个核苷酸组成,在病毒、动物和植物等生物中广泛存在。它可以通过与靶基因mRNA的3’端非编码区(3’UTR)碱基完全或不完全互补配对,使基因mRNA直接降解或者抑制其翻译,导致基因在转录后水平发生沉默,从而影响基因的表达,进而对细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤的发生以及脂类代谢等过程进行调控。目前,关于miRNAs的研究仍处于初步阶段,国内外的研究主要集中于模式生物miRNAs的发现,以及其中与生长发育、疾病发生相关的miRNAs的功能研究,而对于重要的家畜—山羊的miRNAs的研究则相对较少。本试验的目的在于通过分析miR-1和miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)在山羊骨骼肌的发育过程和骨骼肌卫星细胞中的时空表达规律以及功能研究,以了解其在山羊骨骼肌发育过程中的重要作用。1.山羊miR-1和miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)时空表达规律研究。在影响山羊生长发育的众多microRNAs中,选取了两个重要的microRNAs (miR-1和miR-133)作为研究对象,并利用生物信息学方法筛选miR-1和miR-133在山羊生长发育过程中可能的靶基因。通过实时定量PCR的方法检测miR-1和miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)在不同月龄的10个山羊组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、脂肪和背最长肌)中的表达规律。结果表明：miR-1和miR-133在安徽白山羊和波尔山羊各组织中差异表达即miR-1和miR-133在心脏和背最长肌组织中的表达量较高,而在其他组织中表达极低。另外,miR-1在山羊骨骼肌组织中的表达量随着个体成熟表达减少,说明miR-1对肌肉的快速增长极其重要,可以促进肌纤维细胞的大量复制表达,到成体肌细胞增殖和分化都减弱时,表达相对减少。而miR-133随着个体发育其表达量显著增加,到成体时的表达量达到最高,说明成体肌细胞存在增长的现象,且需要miR-133有较高的表达量来促进其增殖。本试验中miR-1和miR-133在安徽白山羊和波尔山羊中的时空表达规律,说明miR-1和miR-133与骨骼肌的发育有密切的联系。另外,miR-1和miR-133在波尔山羊和安徽白山羊骨骼肌组织中的表达量差异显著(P<0.05)。MiR-1和miR-133的靶基因(HDAC4和SRF)在安徽白山羊和波尔山羊各组织中的表达也存在差异即HDAC4和SRF在心脏和骨骼肌组织中的表达量较低,而在其他组织中的表达量相对较高,这与miR-1和miR-133在安徽白山羊和波尔山羊骨骼肌组织中的表达量是截然相反的。除此之外,HDAC4和SRF在不同月龄的安徽白山羊和波尔山羊的骨骼肌组织中的表达趋势与miR-1和miR-133类似,这说明miR-1和miR-133的表达量差异会对靶基因的表达产生影响,进一步对动物骨骼肌的生长与发育产生调控作用。2.MiR-1和miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)在山羊骨骼肌卫星细胞中的表达规律。通过实时定量PCR的方法检测miR-1和miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)在F6、F9和F12代山羊骨骼肌卫星细胞中的表达规律。结果表明：miR-1在F6、F9和F12代山羊骨骼卫星细胞中的表达量随着细胞代数的增多表达量减少,而miR-133在山羊骨骼卫星细胞中的表达量随细胞代数的增多表达也随之增多,这都与其在不同月龄的山羊骨骼肌中的表达趋势相似。另外,靶基因HDAC4和SRF在F6、F9和F12代山羊骨骼肌卫星细胞中的表达趋势与miR-1和miR-133也是相似的。3.MiR-1和miR-133对靶基因(HDAC4和SRF)的调控作用。为了提供更有力的证据来验证HDAC4和SRF基因是否是miR-1和miR-133的靶基因,本研究将miR-1和miR-133 mimics转染至山羊骨骼肌卫星细胞中,然后通过实时定量PCR和Western blotting的方法检测HDAC4和SRF的mRNA表达水平和蛋白水平。首先利用miRNA negative control(发红光)进行转染条件的摸索,发现miRNA negative control的转染浓度为100nM时,转染的效率最高。结果表明,上调miR-1和miR-133的表达水平对山羊骨骼肌卫星细胞HDAC4和SRF mRNA表达水平无明显影响,但蛋白水平显著降低。所以我们初步认为miR-1和miR-133通过抑制山羊骨骼肌卫星细胞HDAC4和SRF基因的翻译而非诱导HDAC4和SRF mRNA的降解抑制HDAC4和SRF蛋白的表达,即miR-1和miR-133在转录后水平抑制HDAC4和SRF蛋白表达。综上所述,本试验通过阐明miR-1和miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)在山羊不同时空和山羊骨骼肌卫星细胞中的表达规律并进一步探明miR-1和miR-133对靶基因的调控作用,为阐明miR-1和miR-133在山羊骨骼肌发育中的具体分子机制奠定了基础。