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目的构建人ATP2A3基因慢病毒shRNA载体并进行鉴定,为进一步探讨盐霉素通过调控ATP2A3基因抗肿瘤干细胞的机理研究提供实验材料。方法1.构建4条ATP2A3基因慢病毒shRNA载体:将目的基因干扰序列连接到pGMLV-SC1RNA干扰慢病毒载体后将其转进细菌感受态细胞中,等生成单克隆菌落后行PCR测序鉴定,测序比对正确的克隆即为所需的ATP2A3基因RNAi慢病毒载体。2.包装慢病毒及测定病毒滴度:抽提高纯度、无内毒素的慢病毒shRNA载体及其辅助包装原件载体质粒,使用HG transgene reagent将两者共转染到293T细胞,通过促转染、换液、培养等处理后,获取细胞上清液,进一步经浓缩后获得高滴度慢病毒浓缩液,在293T细胞中标定其病毒滴度。3.干扰载体对PC-3细胞内ATP2A3的沉默评价:用包装好的慢病毒以及慢病毒阴性对照感染靶细胞PC-3,感染成功后通过Western Blot和RT-PCR方法评价干扰载体对靶基因的干扰效果。结果1.对构建好的4条慢病毒干扰载体经PCR测序鉴定,DNA序列均无位点突变,证明质粒构建成功。2.将构建好的慢病毒载体质粒阳性克隆菌株转染293T细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光;在293T细胞中进行病毒包装,最终纯化出pGMLV-SC1-ATP2A3慢病毒颗粒,并测得其滴度为1*109TU/ml。3.病毒感染靶细胞后,经Western blot及RT-PCR验证,4条shRNA均有一定的沉默,其中以ATP2A3-shRNA4最明显。结论1.通过RNA干扰技术,成功构建了人ATP2A3基因慢病毒shRNA载体。2.构建的干扰载体能够顺利的进行慢病毒的包装,并获得较高的病毒滴度。3.RT-PCR及Western blot检测结果表明,ATP2A3-shRNA4为ATP2A3四个靶点中沉默效果最佳者,由其感染的PC-3细胞株为探讨盐霉素通过调控ATP2A3抗肿瘤干细胞机理研究提供了实验材料。