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第一部分内毒素急性肺损伤大鼠肺组织CXCR4的表达及其作用【目的】通过检测内毒素急性肺损伤(acute lung injury,ALI)时肺组织CXCR4的表达,研究其与炎症细胞因子的表达以及肺损伤病理指标变化之间的关系,探讨其在内毒素引起ALI过程中的作用。【方法】将SD大鼠分为5组:①对照组、②2 h组、③4 h组、④8 h组、⑤12 h组。尾静脉注射LPS,复制ALI模型。在LPS注射后2、4、8、12小时分别用免疫组化、Western Blot及RT-PCR法检测CXCR4、SDF-1α、TNF-α、IL-1β及IL-18在大鼠肺组织中的表达。【结果】SD大鼠肺组织中存在有CXCR4及SDF-1α的表达。LPS导致ALI时,CXCR4及SDF-1α蛋白和mRNA表达明显升高(P<0.05),且与TNF-α、IL—1β及IL-18的表达具有相同的变化趋势。【结论】LPS能促进大鼠肺组织CXCR4及SDF-1α的表达,进而引起大量炎症细胞因子的释放,造成肺组织损害。CXCR4及SDF-1α可能在LPS引起ALI过程中发挥重要作用。第二部分LPS作用下大鼠肺泡巨噬细胞CXCR4的表达及作用【目的】研究LPS作用下体外培养的肺泡巨噬细胞中CXCR4的表达变化与细胞因子表达间的关系,并通过应用CXCR4阻断剂AMD3100干预LPS对巨噬细胞的作用,检测CXCR4与细胞因子的表达变化,进一步探讨CXCR4在LPS激活炎症细胞因子过程中的作用。【方法】将分离培养的大鼠肺泡巨噬细胞随机分组:(1)单独应用LPS刺激肺泡巨噬细胞。(2)用AMD3100预处理肺泡巨噬细胞30min后,再以LPS刺激肺泡巨噬细胞。(3)同时应用AMD3100和LPS刺激肺泡巨噬细胞。(4)LPS刺激肺泡巨噬细胞30min后,再用AMD3100作用于肺泡巨噬细胞。在LPS刺激肺泡巨噬细胞后,分别应用ELISA、Western Blot及RT-PCR法检测肺泡巨噬细胞培养液中TNF-a和IL-6浓度以及肺泡巨噬细胞CXCR4蛋白和mRNA表达的变化。【结果】LPS刺激肺泡巨噬细胞后不同时间CXCR4蛋白和mRNA表达以及肺泡巨噬细胞培养液中TNF-α和IL-6的浓度与正常对照组相比均明显增加(P<0.05)。AMD3 100预处理、AMD3 100与LPS同时应用及AMD3 100迟后于LPS应用时,在LPS作用下,CXCR4蛋白和mRNA均较正常对照组明显增加(P<0.05),与单独应用LPS时相比,CXCR4蛋白和mRNA在各时点的表达无统计学差异(P>0.05)。AMD3100预处理与正常对照组相比,肺泡巨噬细胞培养液中TNF-α和IL-6的浓度均稍增加,差异无显著性(P>0.05);与单独应用LPS刺激时相比,培养液中TNF-α和IL-6的浓度降低,差异有显著性(P<0.05)。AMD3100预处理同与LPS同时应用相比,培养液中TNF-α和IL-6的浓度稍低,差异有显著性(P<0.05)。AMD3100迟后于LPS应用时,与正常对照组相比,肺泡巨噬细胞培养液中TNF-α和IL-6的浓度均较正常对照组增加,差异有显著性(P<0.05),与单独应用LPS刺激时相比,肺泡巨噬细胞培养液中TNF-α和IL-6的浓度降低,但差异无显著性(P>0.05)。【结论】LPS能够刺激肺泡巨噬细胞CXCR4的表达,进而产生大量炎症细胞因子。AMD3100阻断CXCR4后,能够抑制LPS引起的炎症细胞因子释放,表明CXCR4可能在LPS的受体识别及信号转导过程中发挥作用。第三部分CXCR4在内毒素耐受性中的作用机制【目的】通过检测LPS预处理后LPS作用下肺组织和体外培养的巨噬细胞中CXCR4的表达,研究CXCR4与炎症细胞因子表达之间的关系以及LPS预处理对内毒素急性肺损伤的影响,更进一步探讨CXCR4在内毒素引起ALI过程中的作用。【方法】(一)CXCR4在LPS预处理肺组织的表达将SD大鼠随机分组:(1)LPS组以5mg/kg尾静脉注射LPS,复制ALI模型。(2)LPS预处理组首次经腹腔注射LPS(0.25mg/kg),24小时后再经腹腔注射LPS(0.5mg/kg),第2次腹腔注射72小时后,经尾静脉注射LPS(5mg/kg)。尾静脉注射LPS后2、4、8、12小时分别用免疫组化、Western Blot及RT-PCR法检测CXCR4、TNF-α、IL-1β及IL-18在大鼠肺组织中的表达。(二)CXCR4在LPS预处理肺泡巨噬细胞的表达将培养好的肺泡巨噬细胞随机分组:(1)LPS刺激肺泡巨噬细胞后4小时,检测肺泡巨噬细胞细胞因子(TNF-a、IL-1β及IL-18)和CXCR4表达的变化。(2)LPS预先刺激培养12小时,再用LPS刺激肺泡巨噬细胞4小时后,检测肺泡巨噬细胞细胞因子(TNF-α、IL-1p及IL-18)和CXCR4表达的变化。【结果】LPS预处理后,LPS刺激引起的肺组织和肺泡巨噬细胞CXCR4、TNF-α、IL-1β及IL-18的表达均较单独应用LPS组减少,病理学检查指标有不同程度的减轻。【结论】LPS预处理能够减轻内毒素引起的肺损伤,在其过程中,CXCR4的表达下调可能发挥了重要作用。