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研究背景随着人类对宇宙探索的逐步深入,宇航员长时间的太空飞行所造成的骨质丧失日益加重;同时,这也是限制人类对宇宙探索的主要医学问题之一。目前,已采取防护装备、营养补充、体育锻炼、中草药治疗等措施来预防及解决失重状态下骨丧失的这一问题,但其作用效果均不理想。因此,对于失重状态下骨质丧失的相关研究至关重要。骨细胞作为骨组织中最主要的细胞,是维持骨骼正常代谢平衡的重要因素;同时,它也是对力学刺激高度敏感的细胞之一。研究发现,已有许多离子通道与失重状态下的骨质丧失有关,如Ca2+,K+等。但作为维持机体生物学功能重要的阴离子通道与此是否有关,国内外均未见报道。氯离子通道作为最重要的阴离子,参与体内多种重要的生理过程,并且氯离子通道基因突变与某些人类遗传病密切相关。ClC型氯通道(ClC chloride channel)是一大类电压门控型的氯通道,ClC-5作为ClC型氯通道的第二分支,主要参与细胞内体酸化和氯离子的重吸收。近年来,研究发现ClC-5基因敲除的小鼠可表现出生长阻滞和骨发育异常,说明ClC-5可能与细胞的成骨分化有关,且ClC-5基因突变可导致一种罕见的X染色体缺陷综合症-Dent’s病,并可伴有低磷性佝偻病的症状[1],提示我们ClC-5可能与磷代谢异常有关。本课题组前期研究结果显示,模拟失重下悬尾鼠后肢骨骨质出现明显丧失,且血磷升高;而高磷喂养小鼠1月后,后肢骨也出现了明显的骨质丧失,提示磷代谢异常可能是模拟失重下骨丧失的重要原因之一。那么,模拟失重下ClC-5是否在骨丧失中也具有重要作用呢?若是,ClC-5又是否与磷代谢异常相关呢?其中的机制是什么呢?这些都是本课题关注的问题。研究目的本课题的研究目的在于观察模拟失重下ClC-5在骨丧失中的作用,并对其可能的作用机制进行初步探讨。研究方法1.利用悬尾鼠和二维回转器模拟失重,Real-time PCR检测ClC-5在IDG-SW3骨细胞系的表达及表达变化,为后期实验提供实验基础。2.体外培养IDG-SW3骨细胞系,利用脂质体转染的方法,构建瞬时过表达ClC-5及干扰ClC-5氯离子通道表达的IDG-SW3骨细胞系。茜素红染色检测过表达ClC-5后骨细胞的矿化能力,利用Real-time PCR检测成骨相关基因在两种基因表达体系以及两种表达体系模拟失重下的表达状况;探讨模拟失重下ClC-5对骨细胞成骨能力的影响。3.利用Real-time PCR检测破骨相关基因在过表达ClC-5、干扰ClC-5体系以及两种表达体系模拟失重下的表达情况;同时透射电镜观察骨细胞内超微结构,探讨模拟失重下ClC-5对骨细胞破骨能力的影响。4.利用Real-time PCR、能谱分析、细胞内p H染色探讨模拟失重下ClC-5与磷代谢的相关性。5.利用Real-time PCR检测IDG-SW3骨细胞系在高磷状态培养时成骨及破骨相关基因表达的变化,进一步证实高磷状态对骨丧失的作用。研究结果1.模拟失重下ClC-5在骨细胞的表达模拟失重下,悬尾鼠后肢骨骨细胞中的ClC-5蛋白表达升高,且IDG-SW3骨细胞中ClC-5的表达也升高。2.模拟失重下ClC-5对骨细胞成骨能力的影响(1)过表达ClC-5基因,骨细胞成骨相关基因ALP、BSP、OC、Osx的表达升高,细胞体外的矿化能力明显加强。(2)干扰ClC-5表达,骨细胞成骨相关基因ALP、BSP、OC、Osx的表达降低。(3)模拟失重下,骨细胞成骨相关基因ALP、BSP、OC、Osx的表达降低。(4)过表达ClC-5模拟失重后,骨细胞成骨相关基因ALP、BSP、OC、Osx的表达降低。(5)干扰ClC-5表达模拟失重后,骨细胞成骨相关基因ALP、BSP、OC、Osx的表达升高。3.模拟失重下ClC-5对骨细胞破骨能力的影响(1)过表达ClC-5基因,骨细胞破骨相关基因TRAP、RANKL表达降低,RANKL/OPG比值减小。(2)干扰ClC-5表达,骨细胞破骨相关基因TRAP、RANKL表达升高,RANKL/OPG比值增大。(3)模拟失重下,骨细胞破骨相关基因TRAP、RANKL表达升高,RANKL/OPG比值增大,细胞凋亡。(4)过表达ClC-5模拟失重后,骨细胞破骨相关基因TRAP、RANKL表达升高,RANKL/OPG比值增大。(5)干扰了ClC-5表达模拟失重后,骨细胞破骨相关基因TRAP、RANKL表达降低,RANKL/OPG比值减小。4.模拟失重下ClC-5与磷关系的初步研究(1)骨细胞二维回转模拟失重条件下,Pit-1基因表达量升高。(2)过表达ClC-5氯离子通道后,Pit-1基因表达量升高,胞外磷含量增多;干扰ClC-5氯离子通道后,Pit-1基因表达量降低,胞外磷含量减少。(3)干扰ClC-5氯离子通道表达模拟失重后,Pit-1基因表达量降低。(4)模拟失重和干扰ClC-5氯离子通道表达模拟失重后,细胞内p H均降低,且干扰ClC-5基因表达二维回转后细胞内p H较二维回转后升高。(5)髙磷液培养骨细胞后,成骨相关基因ALP、BSP表达降低,破骨相关基因TRAP、RANKL表达升高,RANKL/OPG比值增大。结论1.模拟失重下,骨细胞ClC-5表达显著升高,提示ClC-5参与了模拟失重后的骨改建过程。2.模拟失重条件下ClC-5可致成骨相关基因表达减少,破骨相关基因表达增强,提示ClC-5在模拟失重下的骨丧失中具有重要作用。3.模拟失重条件下,ClC-5可能通过细胞内p H的变化来影响胞外磷含量4.模拟失重下ClC-5可能是通过影响细胞内p H值,升高胞外磷含量,减少成骨,增加破骨,从而最终导致模拟失重后的骨丧失。