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背景与目的:动脉粥样硬化是全世界发病率和死亡率占首要地位的疾病,在其发病过程中内皮细胞损伤起到了重要作用。高脂血症是动脉粥样硬化公认的危险因素之一,且被证实对内皮细胞有损伤作用,但是其中的机制尚不完善。EndMT是内皮细胞在高脂等多种刺激因素作用下向间充质细胞转化的特殊状态,该状态下的内皮细胞的物理屏障功能和分泌功能均受到损害。近年来多项研究表明EndMT可促进动脉粥样硬化的发生发展。但这些研究大多关注动脉粥样硬化斑块形成后内部或相邻内皮层的内皮细胞状态,较少探讨斑块形成前血管内皮细胞发生EndMT的程度。本研究的目的是检测动脉粥样硬化斑块形成前高脂是否会引起内皮细胞发生EndMT,如果可以,再进一步探讨该过程的发生机制。方法:第一部分高脂血症可引起内皮细胞发生EndMT1.收集临床血管标本,并根据血脂情况分为非高脂血症组(N组)和高脂血症组(HLP组),对收集的血管进行冰冻切片免疫荧光实验,使用CD31作为内皮细胞标记物,αSMA作为间质细胞的标记物用以检测EndMT程度。使用LeicaSP8型激光共聚焦显微镜拍照并运用其自带软件分析模块对图片进行分析;2.分离不同周龄的apoE-/-转基因小鼠主动脉,用油红染色以选择动脉粥样硬化早期的小鼠。对选取的小鼠进行眼球取血测量血脂和血浆ox-LDL,并分离小鼠的主动脉,分段后进行免疫荧光enface实验,实验以αSMA作为检测EndMT发生的目的蛋白。使用LeicaSP8型激光共聚焦显微镜连续多张拍照后,将图片使用共聚焦软件进行3D重建,然后使用3D分析模块进行分析;3.使用LDL和ox-LDL对HAECs进行干预,然后使用WB检测VE-cadherin、CD31、fibronectin和αSMA等EndMT相关蛋白的表达情况,以明确使用何种高脂因素进行后续实验的细胞干预条件;并做浓度梯度实验以确定合适的干预浓度。第二部分ox-LDL引起内皮细胞EndMT的机制1.WB检测ox-LDL干预HAECs后TGFβ通路中TGFβ,smad2/3和p-smad2/3等蛋白的表达情况;2.WB检测ox-LDL干预的HAECs中eNOS和p-eNOS的表达情况;使用血管张力检测系统检测apoE-/-小鼠及其野生对照小鼠血管舒张能力以评估其内皮细胞eNOS的功能;然后使用WB检测增强或者抑制eNOS功能后HAECs内EndMT相关蛋白的表达情况。结果:第一部分高脂可引起内皮细胞发生EndMT高脂条件下人肠系膜动脉内皮细胞和apoE-/-小鼠主动脉内皮细胞的EndMT程度均显著升高;ox-LDL干预HAECs后其EndMT程度显著提高并且呈浓度依赖性。第二部分ox-LDL引起内皮细胞EndMT的机制Ox-LDL干预HAECs后TGFβ、smad2/3和p-smad2/3表达增加,证明TGFβ通路参与了该过程的调节。本研究还发现在ox-LDL干预的HAECs内eNOS表达及其功能受抑制,血管舒张功能实验也证实了高脂血症可以抑制内皮细胞eNOS的功能。此外我们通过增强或者抑制eNOS释放NO的能力干预HAECs后发现其EndMT的程度与eNOS的功能呈负相关关系,这证明eNOS可以通过释放NO抑制内皮细胞发生EndMT。结论:在动脉粥样硬化斑块形成前,高脂血症可以通过引起动脉内皮细胞EndMT进而造成内皮细胞损伤,并且这种影响可能是由高脂状态下ox-LDL升高引起的。而ox-LDL主要是通过TGFβ通路和eNOS/NO两条途径调控内皮细胞发生EndMT的,这可能为逆转动脉粥样硬化早期内皮损伤提供新的治疗思路。