论文部分内容阅读
阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病,包括胞内Tau错误折叠形成的神经纤维缠结和胞外Ap多肽异常聚集形成的老年斑两大病理特征,它给人类健康带来了重大威胁。Tau蛋白作为一种微管结合蛋白,其正常生理功能包括协助微管组装和稳定微管结构、保障轴突运输和传递信号,探索Tau蛋白错误折叠和异常聚集的机制是研究阿尔茨海默病的主要方向之一。本文从蛋白质一级结构和分子伴侣角度研究影响Tau蛋白错误折叠的因素。Tau蛋白的序列依赖性聚集已经被证实是其错误折叠的关键机制,在体外已经证实纤维形成片段对Tau蛋白纤维化是至关重要的,因此本文想进一步研究纤维形成片段在Tau蛋白细胞水平聚集机制中的作用。在本文中,我运用刚果红诱导的SH-SY5Y细胞模型来研究在细胞水平Tau蛋白的磷酸化修饰和聚集是否具有序列依赖性。本文通过刚果红体外结合分析、激光共聚焦显微镜观察、透射电子显微镜观察和免疫胶体金电子显微镜观察,首次得出结论：Tau蛋白微管结合核心区片段Tau244-372在可诱导的SH-SY5Y细胞中的聚集和诱导内源Tau蛋白磷酸化修饰具有序列依赖性,两段六肽序列306VQIVYK311 (PHF6)和275VQIINK280(PHF6*)双缺失导致胞内Tau244-372丧失生长纤维和诱导内源Tau蛋白磷酸化修饰的能力,重新插入外源纤维形成片段恢复胞内Tau244-372聚集和诱导内源Tau蛋白磷酸化修饰的能力,插入无关片段胞内Tau244-372仍不能聚集和诱导内源Tau蛋白磷酸化修饰。本文运用量子点标记探针结合Annexin V染色荧光观察和流式细胞术凋亡检测,发现Tau蛋白的聚集引发细胞早期凋亡也具有序列依赖性。以上实验结果证明了在神经细胞中,异源纤维形成片段可以取代PHF6和PHF6*驱动Tau蛋白聚集,正是纤维形成片段决定了Tau蛋白具有生长纤维、诱导细胞凋亡和诱发阿尔茨海默病的能力。本文建立了Tau蛋白序列依赖性聚集的细胞模型,研究了Tau蛋白在细胞水平磷酸化修饰和聚集的机制,为细胞水平神经退行性疾病的起因和发生提供了线索。蛋白质二硫键异构酶(Protein Disulfide Isomerase, PDI)具有二硫键异构酶和分子伴侣等多种生物学功能,在体外可以抑制Tau蛋白的聚集,病理诊断发现PDI和Tau蛋白形成的纤维共定位,因此我想在体外和可诱导细胞模型中研究PDI和Tau蛋白相互作用的机制。本文运用生物信息学方法预测PDI与Tau蛋白微管结合核心区片段Tau244-372相互作用的位点主要分布于PDI的a和a’结构域的两个CGHC活性位点上,通过点突变方法获得了PDI的半胱氨酸突变体,结合等温滴定量热技术首次发现,PDI的a和a’结构域CGHC基序上的四个半胱氨酸(Cys-53、Cys-56、Cys-397和Cys-400)在其与Tau244-372及病理突变体AK280相互作用中起到关键作用：野生型PDI与Tau蛋白单体形成中等强度结合的1：1复合物(解离常数为μM数量级)；PDI a结构域的C53A/C56A和a’结构域的C397A/C400A突变体与Tau蛋白单体形成中等强度结合的2：1复合物；PDI a和a’结构域的CGHC Motif四半胱氨酸C53A/C56A/C397A/C400A突变体则丧失与Tau蛋白单体相互作用的能力。动力学和透射电子显微的实验结果表明,与野生型PDI相比,PDI a和a’结构域半胱氨酸突变体对Tau蛋白纤维生长的抑制作用没有发生明显的变化。在可诱导细胞模型中,通过免疫荧光和免疫印迹检测,发现PDI半胱氨酸突变体和野生型PDI一样显著抑制细胞水平Tau蛋白及其病理突变体ΔK280的病理磷酸化修饰和聚集。因此PDI抑制Tau蛋白病理磷酸化修饰和聚集不依赖于它的两个CGHC活性位点,发挥的主要是分子伴侣的功能。这些发现有益于阐释PDI抑制Tau蛋白错误折叠的细胞和分子机制及其在蛋白质质量控制中的作用。本工作的研究为阐明Tau蛋白错误折叠的调控及机制提供了重要信息,也为阿尔茨海默病的诊断和治疗提供有参考价值的理论依据。