山东省三处盐场环境中嗜盐菌多样性调查及六株嗜盐新菌的分类学研究

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生活在各种极端条件下的微生物越来越引起了人们的关注,极端环境中可能存在很多潜在的新物种资源,有巨大的研究和开发空间。本文主要调查高盐环境中嗜盐菌区系的分布情况,以采自三个不同盐场环境的水样以及沉积物样品为研究对象,同时应用了传统的细菌纯培养方法和Illumina MiSeq高通量测序技术,分别对不同样品中可培养与免培养细菌的群落结构进行了监测。另外,在对嗜盐菌株进行多样性调查的过程中分别从不同盐场样品中分离到了六株嗜盐菌新菌并完成了多相分类鉴定,进一步丰富了嗜盐菌的物种资源库。  本实验从山东省肥城市精制盐场(36°8′24.45″N,116°49′22.46″E),潍坊市开发区盐场(36°59′20.82″N,119°9′56.89″E)以及威海市文登盐场(36°57′56.49″N,122°0′38.85″E)采集水样和泥样。之后利用梯度稀释涂布平板法统计不同样品中可培养微生物的数量。经过表型排重后将菌株分离并保藏,本实验共得到1000余株嗜盐菌。之后用PCR法对764株细菌进行了16S rRNA基因测序,其中88株来自肥城样品,134株来自潍坊样品,其余542株来自文登样品;肥城精致盐场样品中可培养细菌群落结构包括变形菌门(共78株,88%,其中α-变形菌纲3株,占3%;γ-变形菌纲75株,占85%)、厚壁菌门(5株,6%)、拟杆菌门(5株,6%)。潍坊盐场样品中可培养细菌群落结构包括厚壁菌门(82株,61%)、变形菌门(共51株,38%,其中α-变形菌纲5株,占4%;γ-变形菌纲46株,占34%)、拟杆菌门(1株,1%)。文登盐场样品中可培养细菌群落结构包括变形菌门(共405株,75%,其中α-变形菌纲52株,占10%;β-变形菌纲1株;γ-变形菌纲352株,占65%)、厚壁菌门(128株,24%)、拟杆菌门(7株,1%)、放线菌门(2株)。除此之外,发现潜在新物种123株,代表了51个种,其中有14个潜在新属(16S rDNA相似度小于或等于94%)。  通过分类学研究,建议将Balneolaceae、Rhodothemaceae、Chitinophagaceae和Saprospiraceae这4个科划分到噬纤维菌纲成立一个新目,另外我们建议将Fodinibius、Aliifodinibius、Gracilimonas和Balneola成立一个新科,根据最早发表的巴纽尔斯菌属命名为巴纽尔斯菌科(已发表)。并对16S rRNA基因相似度较低的六株嗜盐菌(SYD6T,XJ16T,2W06T,2W32T,JZ3C29T,WDS2C18T)进行了多相分类鉴定。  SYD6T是一株革兰氏阴性,长杆状,氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性,兼性厌氧的新属新种,分离自威海近海盐场沉积物样品。最适生长条件为:37-42℃,盐度6-8%(w/v),并需在此基础上添加2-4%(w/v) MgCl2.6H2O,pH7.5-8.0。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,与之最相近的菌株为长嗜盐刚毛菌(Salisaeta longa),相似度为92.0%。菌株SYD6T的极性脂成分主要由磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、双磷脂酰甘油还有其它一些未知成分的脂质组成。主要的脂肪酸是iso-C15∶02-OH/C16∶1ω7c,iso-C16∶0,C18∶1ω7c/C18∶1ω6c以及C18∶1ω7c;主要的呼吸醌为甲基萘醌MK-7;基因组G+C含量为61.5 mol%(HPLC)。基于系统发育分析、生理生化以及化学组分分析的结果表明,菌株SYD6T代表了细菌分类学上的一个新属新种,建议将其命名为嗜盐长单胞菌(Longimonashalophila gen.nov.,sp.nov.)。模式菌株为SYD6T(=CICC10838T=KCTC42399T)。  XJ16T是一株革兰氏阴性,丝状,兼性厌氧,氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性的新菌,分离自威海鹿道口盐场底泥样品。该菌株具有很强的适应能力,可以很好的适应比较恶劣的条件。最适生长条件为:33-37℃,盐度8-10%(w/v),pH7.5-8.0。基于16S rRNA基因序列的发育分析表明,与之最相近的菌株为嗜硫硫碱弧菌(Thioalkalivibrio sulfidiphilus),相似度为93.1%。菌株XJ16T的极性脂成分由双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱组成。主要的脂肪酸是iso-C15∶02-OH/C16∶1ω7c,C18∶0和C16∶010-CH3;主要的呼吸醌为泛醌Q8;基因组G+C含量为65.9 mol%(HPLC)。基于系统发育分析、生理生化以及化学组分分析的结果表明,菌株XJ16T代表了细菌分类学上的一个新属新种,建议将其命名为黄色嗜盐丝状菌(Halofilum ochraceum gen.nov.,sp.nov.)。模式菌株为XJ16T(=KCTC42259T=MCCC1H00120T=CICC23817T)。  2W06T是一株革兰氏阴性菌株,细胞呈棒状或弯曲棒状,兼性厌氧,氧化酶、过氧化氢酶阳性,分离自威海文登盐场底泥样品。最优生长条件为33-37℃,pH7.5-8.0,盐度8-10%(w/v)。基于16S rRNA基因序列的进化分析显示,与其相似度最高的物种为耐盐螺旋杆菌(Spribacter salinus),相似度为96.4%。菌株2W06T的极性脂主要由双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磺酸基异鼠李糖基二脂酰基甘油和磷脂酰胆碱组成。主要的脂肪酸只有两种,分别为C16∶0和C18∶1ω7c;主要的呼吸醌为泛醌Q8以及甲基萘醌MK-7;基因组G+C含量为65.0mol%。基于系统发育分析、生理生化以及化学组分分析的结果表明,菌株2W06T代表了细菌分类学上的一个新种,建议将其命名为嗜盐螺旋菌(Spiribacterhalophilus sp.nov.)。模式菌株为2W06T(=KCTC42499T=MCCC1H00126T=CICC23868T)。  2W32T是一株革兰氏阴性菌株,细胞呈棒状,兼性厌氧,氧化酶阴性,过氧化氢酶阳性,分离自威海文登盐场底泥样品。最优生长条件为33-37℃,pH7.5-8.0,盐度6-10%(w/v)。基于16S rRNA基因序列的进化分析显示,与其相似性最高的物种为沉积物另矿生菌(Aliifodinibius sediminis),相似度94.6%;其次是这一属的另外一个物种,红色另矿生菌(A.roseus)以及耐盐矿生菌(Fodinibiussalinus),相似度分别为94.4%和93.6%;这三株是仅有的与2W32T16S rRNA基因序列相似度大于90.0%的物种。比较分析16S rRNA基因序列以及系统发育树表明,矿生菌属、另矿生菌属以及另外两个属巴纽尔斯菌属、纤维单胞菌属很可能代表了拟杆菌门下的一个新科。在此基础上,提出建立一个新的分类单元——巴纽尔斯菌科(Balneolaceae fam.nov.),模式属是巴纽尔斯菌属(Balneola gen.nov.)。菌株2W32T的极性脂主要由双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱以及其它一些未知的醣脂、氨基脂以及脂质组成;主要的脂肪酸由iso-C15∶0,iso-C17∶1ω9c和summed feature3(C16∶1ω7cand/or iso-C15∶02-OH)组成;主要的呼吸醌是甲基萘醌MK-7;基因组G+C的含量为47.5 mol%(HPLC)。综合比较16S rRNA基因序列表明,2W32T是另矿生菌属下的一个新种。建议将其命名为嗜盐另矿生菌(Aliifodinibius halophilus sp.nov.);模式菌株为2W32T(=KCTC42497T=CICC23869T)。  JZ3C29T是一株革兰氏阴性菌株,细胞呈长杆状,兼性厌氧,氧化酶阴性,过氧化氢酶阳性,分离自肥城市精致盐场卤水样品。最优生长条件为37-40℃,pH7.5-8.0,盐度8-10%(w/v)。基于16S rRNA基因序列的进化分析显示,与其相似性最高的物种为热带纤维单胞菌(Gracilimonas tropica),相似度为90.5%。菌株JZ3C29T的极性脂主要包括双磷脂酰甘油,磷脂酰乙醇胺、几种糖脂,若干磷脂质和部分含量较少的未知类型的脂类。主要的脂肪酸是summed feature3(C16∶1ω7c and/or iso-C15∶02-OH)和iso-C15∶0;主要的呼吸醌为甲基萘醌MK-7;基因组G+C含量为44.4 mol%。基于系统发育分析、生理生化以及化学组分分析的结果表明,菌株JZ3C29T代表了细菌分类学上的一个新属新种,建议将其命名为嗜盐红色盐杆菌(Rhodohalobacter halophilus gen.nov.,sp.nov.)。模式菌株为JZ3C29T(=KCTC52046T=MCCC1H00131T)。  WDS2C18T是一株革兰氏阴性菌株,细胞呈长杆状,兼性厌氧,氧化酶阴性,过氧化氢酶阳性,分离自文登盐场水样。最优生长条件为37-40℃,pH7.5-8.0,盐度8-12%(w/v)。基于16S rRNA基因序列的进化分析显示,与其相似性最高的物种为嗜盐长单胞菌(Longimonas halophila),即由本实验室分离鉴定并发表的嗜盐菌SYD6T,相似度为90.0%。菌株WDS2C18T的极性脂由双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、糖脂类、磷脂类以及其它一些未知成分的脂质组成。主要的脂肪酸是iso-C15∶02-OH/C16∶1ω7c,iso-C17∶1ω9c,iso-C15∶0以及iso-C17∶0;主要的呼吸醌为甲基萘醌MK-7;基因组G+C含量为58.1 mol%。基于系统发育分析、生理生化以及化学组分分析的结果表明,菌株WDS2C18T代表了分类学上的一个新属新种,建议将其命名为盐场长杆菌(Longibacter salinarum gen.nov.,sp.nov.)。模式菌株为WDS2C18T(=KCTC52045T=MCCC1H00132T)。
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