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目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）认知功能障碍的程度与突触损伤密切相关,突触后膜AMPA受体尤其是Glu A1亚基膜表达减少导致海马突触可塑性异常是AD认知功能障碍与突触损伤的关键因素。AD脑内caspase-1与IL-1β表达水平上调,敲除或抑制caspase-1通过抑制炎症逆转AD认知功能障碍。研究也发现,caspase-1抑制正常鼠海马AMPA受体介导的钙内流和突触可塑性;IL-1β抑制AMPA受体亚基Glu A1膜表达,进而损伤树突棘结构性重塑抑制长时程增强形成;IL-1β通过抑制AMPA受体亚基Glu A1磷酸化、膜表达损伤海马依赖的学习与记忆。这些研究表明,caspase-1作为IL-1β成熟的限速酶,可能也参与调节Glu A1膜转运与突触可塑性改变。因此,AD脑内caspase-1活性增加是否参与调节Glu A1膜表达进而损伤突触功能与认知功能,需要进一步实验证实。stargazin是近年来备受关注的一种AMPA受体辅基蛋白。研究证实,stargazin是调节海马神经元AMPA受体Glu A1亚基（Glu A1-containing AMPARs）突触膜转运的关键蛋白:stargazin通过C末端PDZ结构域与Glu A1亚基结合,再与PSD-95结合形成复合体,然后以复合体形式将Glu A1快速运送至突触表面。Stargazin PDZ结构域苏氨酸321位点被丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）中的p38 MAPK信号分子磷酸化,可显著抑制AMPAR的突触转运过程。caspase-1可激活p38 MAPK抑制AMPA受体膜转运导致抑郁发生。因此,stargazin是否参与caspase-1调节AD脑内AMPA受体膜转运,需要进一步实验验证。本实验采用AD体内与体外模型,采用分子生物学、行为学实验等技术探讨caspase-1是否参与调控Glu A1膜表达,同时探讨caspase-1调控Glu A1膜表达的机制。方法:1.8月龄APP/PS1小鼠给予caspase-1抑制剂AC-YVAD-CMK处理,Morris水迷宫检测APP/PS1小鼠的空间学习与记忆能力,免疫组织化学与硫磺素S染色检测海马A（?）斑块的沉积情况,TUNEL染色检测海马神经细胞凋亡情况,ELI-SA法检测IL-1（?）浓度,Western blotting检测海马Glu A1膜表达情况。2.取小鼠神经元细胞HT-22,用10μM浓度的Aβ1-42寡聚体在体外构建了阿尔茨海默病细胞模型。Annexin V/PI法流式细胞仪检测AD细胞模型细胞凋亡情况,Western blotting检测AD细胞模型海马神经元caspase-1、Glu A1膜表达情况。AD细胞模型给予caspase-1抑制剂AC-YVAD-CMK处理,Annexin V/PI法流式细胞仪检测AD细胞模型细胞凋亡情况,ELISA法检测IL-1（?）浓度,Western blotting检测AD细胞模型海马神经元Glu A1膜表达情况。3.利用AD体内、体外模型,研究stargazin表达与功能变化,Western blotting检测stargazin表达情况,CO-IP验证stargazin与Glu A1结合情况。制备好载体pc DNA3.1-Stargazin突变体,转染至小鼠海马神经元细胞HT-22,用10μM浓度的Aβ1-42寡聚体孵育,Western blotting检测Glu A1膜表达情况。结果:1.caspase-1抑制剂AC-YVAD-CMK对AD小鼠模型认知功能、病理特征、Glu A1膜表达的影响1.1 Morris水迷宫空间航行试验结果显示,与对照组相比,8月龄APP/PS1小鼠寻找隐藏平台的潜伏期较长,差异具有统计学意义（P＜0.05）,表明APP/PS1小鼠寻找隐藏平台的学习能力存在损伤,即8月龄APP/PS1小鼠存在空间学习能力受损。APP/PS1小鼠给予caspase-1特异性抑制剂AC-YVAD-CMK处理后,APP/PS1小鼠寻找隐藏平台的潜伏期明显缩短,数据差异具体显著性（P＜0.05）。这些数据表明,AC-YVAD-CMK处理可改善8月龄APP/PS1小鼠空间学习能力。Morris水迷宫空间探索实验结果显示,与对照组相比,APP/PS1小鼠穿越平台的次数明显减少,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而AC-YVAD-CMK处理可明显增加APP/PS1小鼠穿越平台的次数,差异具有统计学意义（P＜0.05）,这些结果表明,Caspase-1特异性抑制剂AC-YVAD-CMK可逆转APP/PS1小鼠空间记忆能力损伤,即抑制Caspase-1活性可改善AD转基因APP/PS1小鼠的空间记忆减退。1.2免疫组织化学与硫磺素S染色检测Aβ斑块在小鼠海马的沉积,结果显示:对照组海马区域内,免疫组织化学与硫磺素S染色方法均未检测Aβ斑块;而APP/PS1小鼠海马Aβ斑块数量与面积增多,AC-YVAD-CMK处理后的APP/PS1小鼠海马Aβ斑块数量与面积减少,差异具有显著性（P＜0.05）。这表明,AC-YVAD-CMK治疗能够有效减少APP/PS1小鼠海马区的Aβ斑块。1.3研究结果显示,与对照组相比,APP/PS1小鼠增加了海马CA1区TUNEL阳性细胞（即凋亡的神经细胞）数量;与此相反,AC-YVAD-CMK能够显著逆转APP/PS1小鼠海马CA1区神经细胞凋亡数量的增加。结果表明,AC-YVAD-CMK能显著降低APP/PS1小鼠海马CA1区神经细胞凋亡。1.4 ELISA法检测caspase-1通路下游产物IL-1β的浓度。结果提示,与对照组相比,APP/PS1小鼠海马IL-1β浓度显著上调,但APP/PS1小鼠给予caspase-1抑制剂AC-YVAD-CMK处理后,海马IL-1β浓度明显下降,具有显著性差异（P＜0.05）。这些结果表明,AC-YVAD-CMK可抑制APP/PS1小鼠caspase-1功能。1.5 Western blotting检测膜表面和细胞质Glu A1蛋白表达情况。结果显示,与对照组相比,APP/PS1小鼠海马Glu A1膜表达明显减少,而AC-YVAD-CMK处理后,逆转APP/PS1小鼠海马脑区Glu A1膜表达的减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）。研究结果证实,AC-YVAD-CMK可提高APP/PS1小鼠海马脑区Glu A1膜表达。2.capase-1抑制剂AC-YVAD-CMK对AD细胞模型凋亡、Glu A1膜表达的影响2.1 Annexin V/PI法流式细胞仪观察细胞凋亡情况,结果所示,与对照组相比,AD细胞模型组细胞凋亡增多,差异具有统计学意义（P＜0.01）。2.2 AD细胞模型中caspase-1表达增高,具有显著性差异（P＜0.05）。而且,与对照组相比,AD细胞模型中Glu A1膜表达明显减少,差异具有统计学意义（P＜0.01）。ELISA法检测caspase-1通路下游产物IL-1β的浓度,AD细胞模型中IL-1β浓度明显增高,差异具有统计学意义（P＜0.01）。这些结果表明,Aβ1-42诱导的AD体外模型中,caspase-1、IL-1β表达增加,Glu A1膜表达减少。2.3 Annexin V/PI法流式细胞仪结果显示,与对照组相比,AC-YVAD-CMK组流式细胞仪检测细胞凋亡明显减少（P＜0.05）,而IL-1β组增加细胞凋亡（P＜0.05）,差异均具有统计学意义。ELISA法检测各组IL-1β的浓度结果显示,AC-YVAD-CMK抑制AD细胞模型中caspase-1功能。这些结果表明,Aβ1-42寡聚体诱导的AD体外模型,Aβ1-42寡聚体通过激活caspase-1/IL-1β通路促进细胞凋亡,而抑制caspase-1功能会阻断该过程,具有细胞保护作用。2.4 Western blotting检测结果显示,与对照组相比,AC-YVAD-CMK组提高海马神经元细胞Glu A1膜表达,差异具有显著性（P＜0.01）。而在AC-YVAD-CMK与IL-1β共处理情况下,AC-YVAD-CMK提高海马神经元细胞Glu A1膜表达的作用被阻断。这些结果表明,Aβ1-42寡聚体通过激活caspase-1/IL-1β通路抑制海马神经元细胞Glu A1膜表达,caspase-1功能被抑制,可促进海马神经元细胞Glu A1上膜。3.stargazin参与caspase-1调控Glu A1膜表达3.1 Western blotting检测小鼠海马stargazin的表达变化,结果显示:相比对照组,APP/PS1小鼠海马stargazin表达增高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。而APP/PS1小鼠+AC-YVAD-CMK处理后海马stargazin表达与APP/PS1小鼠相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。这些结果表明,AD转基因小鼠模型海马stargazin表达增高,且caspase-1抑制剂AC-YVAD-CMK不影响stargazin表达。AD体外细胞模型中stargazin的表达情况,结果显示,与对照组相比,Aβ1-42寡聚体诱导的AD体外模型的stargazin表达增高,差异具有统计学意义（P＜0.01）。3.2采用免疫共沉淀方法验证AD体外模型中stargazin与Glu A1的结合,结果显示,与对照组相比,Aβ1-42寡聚体诱导的AD体外模型中stargazin与Glu A1结合降低,而抑制caspase-1功能可促进stargazin与Glu A1结合,差异具有统计学意义（P＜0.01）。这些结果表明,caspase-1具有抑制stargazin与Glu A1相互作用的功能。3.3我们采用点突变技术,使得stargazin PDZ结构域苏氨酸残基321突变,进一步转染至海马神经元细胞,以探索caspase-1调控stargazin与Glu A1相互作用的机制。研究结果显示,与对照组相比较,stargazin突变组海马神经元细胞Glu A1的膜表达增高,差异具有统计学意义（P＜0.01）。因此,caspase-1作用于stargazin,进而抑制stargazin与Glu A1相互作用,减少Glu A1的膜表达。而starga-zin PDZ结构域苏氨酸残基321突变后,caspase-1不抑制突变的stargazin的功能,逆转Glu A1膜表达减少。结论:1.caspase-1抑制剂AC-YVAD-CMK逆转APP/PS1小鼠空间学习与记忆障碍,抑制APP/PS1小鼠caspase-1功能,减少IL-1β表达,降低Aβ斑块沉积与神经细胞凋亡,提高Glu A1膜表达;2.caspase-1抑制剂AC-YVAD-CMK抑制AD细胞模型caspase-1功能,减少IL-1β表达,降低神经元细胞凋亡,提高Glu A1膜表达;3.stargazin参与caspase-1调控Glu A1膜表达,caspase-1抑制剂AC-YVAD-CMK可促进stargazin与Glu A1结合,提高Glu A1膜表达;caspase-1通过抑制stargazin的功能,导致stargazin与Glu A1结合及Glu A1膜表达减少,引起认知功能障碍。