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研究背景及目的:大肠癌肿瘤抑制基因的高甲基化修饰是抑制其表达的主要机制。而5hm C是去甲基化过程中的一个中间体,传统的甲基化检测方法不能区分甲基化(5m C)和羟甲基化(5hmc)修饰,因此准确分析大肠癌全基因组异常5m C和5hm C修饰有利于发现大肠癌肿瘤相关基因。TET1是近年来发现的重要的去甲基化酶,可通过降低肿瘤抑制基因的高甲基化水平,使其重新活化。而TET1基因的聚ADP核糖基化可调节其转录和表达。但组蛋白单ADP核糖基化作为聚ADP核糖基化的基础是否可以通过影响TET1,从而调节大肠癌肿瘤抑制基因甲基化水平尚不清楚。方法:本研究第一部分应用HMST-seq方法,检测16对结直肠癌和正常对照组织全基因组5m C和5hm C位点,并分析存在差异甲基化和羟甲基化修饰的区域。并应用WEB-based GEne Se T Ana Lysis Toolkit(Web Gestalt)对有异常甲基化或羟甲基修饰的基因进行功能富集分析,筛选出结直肠癌相关基因。第二部分从筛选出的直结肠癌相关基因中,选择TFPI2为研究对象,并选用课题组先前构建的H3R117单ADP核糖基化修饰位点突变Lo Vo细胞(H3R117A Lo Vo细胞),分析组蛋白H3R117单ADP核糖基化对TFPI2甲基化修饰的影响及涉及TET1的可能机制:应用甲基化免疫沉淀和羟甲基化免疫沉淀法分别检测TFPI2启动子的甲基化和羟甲基化水平,采用Ch IP实验对TFPI2启动子片断上TET1、PAR、H3K4me3、H3K9me3的富集进行检测,应用q PCR和western blot方法,检测TET1的m RNA水平和蛋白水平,采用甲基化免疫沉淀对TET1启动子的甲基化水平进行检测,应用染色质可接近性实验,检测TET1基因启动子片断的松解程度,采用Ch IP实验对TET1启动子片断上PAR、PARP1、H3K4me3、H3K9me3的富集进行检测。结果:第一部分:16例正常对照组织中,平均识别出1,162,336个5m C位点和106,907个5hm C位点,16例肿瘤标本中平均识别出1,105,904个5m C位点和75,236个5hm C位点。并鉴别出726个异常甲基化修饰位点(DMRs),其中87.47%在肿瘤中为高甲基化修饰;689个异常羟甲基化修饰位点(Dh MRs),其中79.97%在肿瘤中为低羟甲基化修饰。726个DMRs中,分布于基因间隔区和基因体中的比例为83.88%,分布于转录起始位点附近和转录起始位点区域的比例为13.22%;689个Dh MRs中,分布于基因间隔区和基因体中的比例为77.51%,分布于转录起始位点附近和转录起始位点区域的比例为20.17%。通过生物信息学的功能富集分析,筛选出了53个存在DMR的基因和56个存在Dh MR的基因与结直肠癌相关。在上述基因中,发现ALOX15,GHRHR,TKTL1和TFPI2 4个基因在启动子或转录起始位点区域有相同的DMR和Dh MR位点。第二部分:H3R117A Lo Vo细胞组较对照和空载组细胞比较,其TFPI2启动子片断甲基化和羟甲基化修饰水平均降低、TET1和H3K4me3的富集增加、H3K9me3富集明显减少、而PAR没有差别;TET1的m RNA和蛋白水平均增加,TET1基因启动子片断甲基化水平减少、染色质松解程度增加、PAR和H3K4me3的富集增加、PARP1富集减少、但H3K9me3富集没有差异。结论:1.本研究提供了异常表观遗传学修饰的大肠癌相关基因的实验依据,也为大肠癌甲基化组学和羟甲基化组学提供了新的数据。2.H3 R117单ADP核糖基化修饰可以影响去甲基化酶TET1的转录和表达,从而调控TFPI2的甲基化,在大肠癌发展过程中发挥促进作用。本研究从表观遗传学角度,为组蛋白H3单ADP核糖基化修饰的R117位点成为大肠癌新的治疗候选靶点提供了实验依据。