研究背景慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)简称慢阻肺,是一种既可预防亦可治疗的常见疾病,以持续存在的气流受限为特征,气流受限多呈进行性发展,与气道和肺组织对有害颗粒或气体所致异常慢性炎症反应有关,急性加重和合并症影响患者整体疾病的严重程度。据世界银行／世界卫生组织的资料表明,到2020年,COPD将成为世界第三大死亡原因,居世界经济负担第五位。我国40岁以上人群COPD患病率为8.2%,每年致残人数达500-1000万,致死人数达100万。由于COPD患病人数多,死亡率高,社会负担重,已成为一个重要的公共卫生问题。COPD系阻塞性通气功能障碍,呼吸运动需要克服更大阻力,消耗更多能量。呼吸肌长期超负荷运动,导致骨骼肌过度做功,最终功能下降、肌无力。临床上,终末期慢性阻塞性肺疾病患者顽固性气促,多为呼吸肌无力,须长期使用机械辅助通气；部分患者经有创机械通气后,呼吸机依赖,难以撤机；均给目前的治疗带来困难。另一方面,香烟对骨骼肌的损伤,导致呼吸肌无力。吸烟与慢性阻塞性肺疾病为恶性循环,最终导致呼吸肌无力、顽固性气促、呼吸衰竭、死亡。COPD既是一种以持续存在的气流受限为特征的慢性气道疾病,同时也是一种涉及多器官受损的全身疾病。COPD不仅累及肺脏,同时也涉及多器官受损,包括骨骼肌功能障碍(Skeletal Muscle Dysfunction, SMD)和其他系统功能障碍(如心血管系统、神经系统、消化系统等)。过去一直认为COPD患者出现运动受限主要是因为肺功能受损所致,但近年来越来越多的研究发现,在运动受限的COPD患者中,约40%患者肺功能并没有严重受损,而表现为明显的SMD。运动受限是COPD患者常见的临床症状,也是COPD患者生活质量下降的重要因素。COPD患者的骨骼肌功能障碍,会进一步恶化COPD患者的健康状况,影响患者的生活质量,尤其对中、重度COPD患者。研究表明,COPD患者常见骨骼肌无力,可早于恶病质；晚期COPD患者骨骼肌明显萎缩,与呼吸功能、活动耐量、健康状态和死亡率增加有关。COPD患者SMD的发生是一个多因素、多种分子生物学机制共同参与的复杂机制,目前尚未完全明了。吸烟是罹患COPD的主要危险因素,点燃烟草可产生大量的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)导致氧化应激。呼吸系统不仅是氧化应激的主要靶器官,ROS可以随着血液循环分布于全身任何脏器,而肌肉组织作为人体最大体积器官组织,同样也是氧化应激最大的“受害者”。有证据显示,COPD患者骨骼肌组织的氧化应激明显增加,且这种增加与其活动能力和活动耐力呈负相关。目前肌生成抑制素(Myostatin, MSTN)的研究日益成为国内外研究热点。肌生成抑制素(Myostatin, MSTN)又名生长／分化因子-8(GDF-8),是转化生长因子(TGF-β)超家族中的一员,主要作用于骨骼肌,抑制肌肉的生长发育,对骨骼肌的生长具有负调控作用,最终导致肌肉消耗和萎缩。同其他TGF-β家族成员一样,它是以375个氨基酸的形式合成的蛋白质。MSTN除在骨骼肌中表达外,它在分泌后可进入到血液循环中。已有研究显示,随着年龄增长,在体重下降和有骨骼肌消耗症状的老年患者,MSTN在血浆中的浓度呈增加趋势。MSTN对骨骼肌生长的负调控作用主要通过抑制细胞周期过程,遏制成肌细胞的增殖。1873年,法国人兰维尔(Ranuier)将骨骼肌纤维区分为红肌和白肌,其中红肌收缩较慢,白肌收缩较快。随着技术的发展,1970年,利用肌球蛋白腺苷三磷酸酶(ATP_ase)反应法将哺乳动物骨骼肌分为Ⅰ、ⅡA、和ⅡB三型。随后运用肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MHC)单克隆抗体进行免疫组化实验、原位杂交实验、单个肌纤维MHC SDS-PAGE电泳和基因克隆等技术,进一步将骨骼肌分型。目前常用方法系将人体骨骼肌纤维分为三型：Ⅰ型为慢收缩耐疲劳需氧型、ⅡA型为快收缩易疲劳糖酵解型、ⅡB型为快收缩耐疲劳需氧-糖酵解型。运动可以导致肌球蛋白重链不同亚型之间的转变,而且是相邻类型间的转变。Cosker等发现,在COPD患者中存在Ⅰ→ⅡA→ⅡB骨骼肌纤维类型之间的转变,伴有氧化代谢能力降低；则骨骼肌纤维以ⅡB型为主,耐力、力量均下降。与同年龄的健康对照者相比,COPD患者骨骼肌力量下降,且下肢比上肢明显,尤其股四头肌的耐力明显下降,抗氧化治疗可以改善COPD患者的骨骼肌活动耐力,这更进一步证实了氧化应激与COPD骨骼肌功能障碍有着因果联系。研究发现COPD患者戒烟后,表现为体重增加,肢体周径增长,运动耐力增加,生活质量显著提高,我们日常临床实践也时常发现此现象。故认为,除了运动能令骨骼肌纤维类型间相互转换,推测香烟也可致骨骼肌不同肌纤维类型的转换。综上,吸烟是COPD重要发病原因,吸烟造成的氧化应激可造成DNA氧化损伤,并在COPD患者的SMD中起重要作用。本课题在预实验中经发现香烟烟雾(CSE)刺激的大鼠股四头肌细胞,随CSE浓度升高,氧化损伤程度增加,MSTN含量亦升高,提示吸烟所致的氧化损伤可能与MSTN表达升高有关,但具体机制尚不清楚。另一方面,COPD患者骨骼肌纤维类型发生Ⅰ→ⅡA→ⅡB的转变,伴有氧化代谢能力降低；且骨骼肌纤维以ⅡB型为主,耐力、力量、速度均下降。基于COPD患者存在骨骼肌消耗症状以及MSTN抑制骨骼肌生长的作用,香烟烟雾可造成氧化应激和MSTN基因表达增加,以及香烟烟雾可致不同骨骼肌肌纤维类型的转换。故我们大胆地推测COPD患者SMD可能与MSTN的表达增加有关,香烟烟雾刺激可增加股四头肌MSTN的表达；故本实验依据香烟烟雾暴露可导致COPD以及骨骼肌损伤的原理,以体外培养、鉴定后的SD大鼠大腿股四头肌骨骼肌细胞作为研究靶细胞,建立不同浓度CSE刺激体外培养SD大鼠的大腿股四头肌细胞损伤的模型,采用荧光定量PCR方法、蛋白免疫印迹法对肌细胞中的MSTN基因水平、蛋白水平进行检测,同时荧光定量PCR方法检测骨骼肌纤维类型的变化,探讨CSE刺激对大鼠骨骼肌细胞表达MSTN及骨骼肌纤维类型转变的影响,为进一步阐明COPD患者骨骼肌功能障碍的发病机制,并对其进行治疗提供科学依据。研究目的本研究从细胞模型水平,采用分子生物学和生理学的方法,研究MSTN参与COPD骨骼肌功能障碍的发病机制,以及骨骼肌纤维的转换,为进一步阐明COPD骨骼肌功能障碍的发病机制并对其进行治疗提供提供新的思路及策略。再者,证实香烟对骨骼肌的毒性作用,戒烟是防治COPD/肺气肿的重要有效措施,具有重要的临床和社会价值。研究对象及方法1、,对象；1)体外培养股四头肌细胞：选鼠龄3～5 d的SD大鼠拉颈处死,取大腿股四头肌肌肉,去脂肪、血液、结缔组织,剪碎1mm3;在体外行骨骼肌原代细胞培养(分别行组织块培养、单层细胞培养),倒置相差显微镜观察细胞形态特征；2)细胞鉴定：取第3-5代细胞分化成熟后,行苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态特征,以及细胞免疫荧光鉴定；明确贴壁细胞为骨骼肌细胞。2、方法：1)实验分组：取第10代以内细胞,当细胞覆盖50%培养瓶时,分别加入含有0%、2.5%、5%、10% CSE的胎牛血清培养基(香烟提取物统一为使用前30分钟制备),放置培养箱48小时后；随机分四组：正常对照组、2.5% CSE组、5.0%CSE组、10.0%CSE组。2)基因水平检测：分别提取四组细胞的RNA,逆转录合成cDNA,实时定量PCR检测MSTN mRNA、MHC-Ⅰ mRNA、MHC-ⅡA mRNA、MHC-ⅡB mRNA的表达。3)蛋白水平检测：分别提取四组细胞的蛋白,煮沸变性,电泳、电转,Western blotting检测MSTN蛋白的表达。4)统计学方法：计量资料以(X±s)表示,多组间比较采用单因素one-way ANOVA方差分析检验,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果(1) 体外成功原代培养SD大鼠骨骼肌细胞：SD大鼠骨骼肌细胞在倒置显微镜下观察可见,骨骼肌细胞刚铺板于胎牛血清培养基时细胞呈圆形,形态均一,折光性强,悬浮于培养基中；5-6 h后开始贴壁,24 h后完全贴壁,并开始增生,细胞逐渐延伸成梭形,相互融合,按一定方向有序排列。随细胞密度的增加,细胞逐渐有规律地平行排列；培养至2～3 d时细胞分化达到高峰,随后逐渐开始凋亡、漂浮。HE染色可见细胞核呈扁椭圆形,染成蓝色,符合骨骼肌细胞的形态学特点；细胞免疫荧光检查提示90%以上的细胞呈阳性反应,细胞核染成蓝色,符合骨骼肌细胞的表型特征。(2) MSTN mRNA实时定量PCR检测结果显示：4组MSTN mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)；其中,5.0%组、10.0%组MSTN mRNA相对表达量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；伴随CSE的浓度升高,目标基因表达越高。支持当初的实验设想,MSTN随CSE的浓度升高,表达越高,(P<0.05)。(3) MHC-Ⅰ mRNA实时定量PCR检测结果显示：4组MHC-Ⅰ mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)；其中,5.0%组、10.0%组MHC-Ⅰ mRNA相对表达量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；伴随CSE的浓度升高,目标基因表达越低。支持当初的实验设想,MHC-Ⅰ随CSE的浓度升高,表达越低,(P<0.05)。(4) MHC-ⅡA mRNA实时定量PCR检测结果显示：4组MHC-ⅡA mRNA相对表达量比较,其中,2.5%组、5.0%组、10.0%组MHC-ⅡA mRNA相对表达量低于对照组,只有2.5%组差异有统计学意义(P<0.05);而5.0%组、10.0%组差异无统计学意义(P>0.05)。(5) MHC-ⅡBmRNA实时定量PCR检测结果显示：经3次更换MHC-ⅡB的引物,反复实验,均未能作出扩增曲线及溶解曲线。(6) MSTN蛋白Western blotting检测结果显示：4组MSTN蛋白表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)；其中,5.0%组、10.0%组MSTN蛋白表达水平高于对照组和2.5%组,差异有统计学意义(P<0.05)；伴随CSE的浓度升高,目标蛋白表达越高。支持当初的实验设想,MSTN随CSE的浓度升高,表达越高,(P<0.05)。结论1、香烟提取物可致体外骨骼肌细胞变形、凋亡,浓度越高、刺激时间越长,表现越明显。2、香烟提取物刺激骨骼肌细胞内肌肉生长抑制素的mRNA基因及蛋白水平升高,其水平随CSE浓度的升高而升高,提示吸烟可导致骨骼肌功能障碍、萎缩。3、香烟提取物刺激骨骼肌细胞后,MHC-Ⅰ、MHC-ⅡAmRNA基因表达水平下降,吸烟可导致MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ型骨骼肌纤维减少。