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背景与目的：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是一种高致死性的恶性肿瘤，并且其发病率越来越高，为世界范围内癌症死亡的第三大原因，对人类的健康造成严重威胁。近年来，随着诊断技术的进步以及肝切除、肝移植、局部消融治疗和经动脉化疗栓塞等手术治疗技术的发展，HCC患者生存率和生活质量显著改善，但是在大多数国家其发病率依旧几乎等于死亡率，5年生存率依然不超过30%。这说明早期诊断现状和有效治疗方法亟待进一步改善。因此，深入研究HCC发生发展的分子病理机制以探索新的诊断治疗分子对于改善HCC的诊断治疗现状至关重要。
含DEP结构域的蛋白质1 (DEP domain containing 1,DEPDC1)是一种高度保守的蛋白质，它位于1p31.3，主要表达于睾丸，但在人类其他正常组织中没有检测到表达。近年来，有报道表明DEPDC1在多种肿瘤中表达上调，并且在肿瘤发生和发展中发挥了重要作用。例如， DEPDC1 在膀胱癌发生过程中表达是上调的，通过小干扰 RNA （small-interfering RNA，siRNA)抑制其表达后可以显著抑制膀胱癌细胞的生长。在鼻咽癌组织中，DEPDC1的表达也明显上调，敲低DEPDC1的表达导致肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭受到明显抑制。综上所述，DEPDC1通常作为癌基因发挥作用。此外，有证据表明在HCC中DEPDC1的表达也明显上调，上调的DEPDC1表达与不良预后相关。据报道，通过肽段 11R-DEP破坏DEPDC1-ZNF224复合物可诱导HepG2细胞凋亡并抑制其增殖。此外，也有研究表明DEPDC1上调可诱导HCC细胞增殖和肿瘤转移能力。综上所述，DEPDC1在肝癌发生和发展中可能发挥着重要作用。然而，DEPDC1在HCC中的作用研究还不够全面，其下游调控机制尚不清楚。因此，本研究拟进一步探讨DEPDC1在HCC中的作用，并深入研究其下游机制。
方法：（1）通过Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT)数据库分析DEPDC1在肝癌组织和肝正常组织中的表达；通过western blot实验检测DEPDC1蛋白在四株HCC细胞（Li-7、Huh-7、SNU-387、Hep3B）中的表达，然后筛选合适的细胞株进行基因干扰。设计并合成 DEPDC1siRNA ，通过 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)和 western blot实验检测DEPDC1 siRNA的干扰效果。
（2）通过 CCK-8 实验检测 DEPDC1 基因干扰后对 Huh-7 和SNU-387细胞增殖的影响；通过克隆形成实验检测DEPDC1基因干扰后对Huh-7和SNU-387细胞克隆形成能力的影响；通过transwell实验检测干扰DEPDC1基因表达后对Huh-7和SNU-387细胞侵袭能力的影响。
（3）构建DEPDC1短发夹（DEPDC1 short hairpin RNA，DEPDC1 shRNA），转染Huh-7细胞，并筛选Huh-7细胞DEPDC1 shRNA干扰稳定细胞株，通过裸鼠成瘤实验观察DEPDC1基因干扰对肿瘤生长的影响。
（4）构建DEPDC1过表达质粒，转染Li-7和Hep3B细胞，通过RT-PCR和western blot实验检测DEPDC1过表达质粒转染细胞后表达效果；通过CCK-8实验检测DEPDC1基因表达上调后对Li-7和Hep3B细胞增殖的影响；通过克隆形成实验检测DEPDC1基因表达上调后对Li-7和Hep3B细胞克隆形成能力的影响；通过transwell实验检测上调DEPDC1基因表达后对Li-7和Hep3B细胞侵袭能力的影响。
（5）Huh-7细胞转染DEPDC1 siRNA和对照（Scrambled negative control，NC）后，通过人基因表达谱芯片检测DEPDC1在HCC进展中的可能调节机制，利用DAVID Bioinformatics Resources 6.7进行基因本体（gene ontology，GO）注释和信号通路富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)。
（6）通过RT-PCR实验检测收集的12例HCC组织及其对应的癌旁正常组织中 DEPDC1、CCL20 和 CCR6 mRNA 的表达，并分析DEPDC1与CCL20、DEPDC1与CCR6以及CCL20与CCR6表达的相关性。
（7）通过western blot实验检测DEPDC1过表达对Li-7和Hep3B细胞中CCL20和CCR6蛋白表达的影响；设计合成CCL20和CCR6干扰siRNA，通过western blot实验检测CCL20和CCR6基因干扰对DEPDC1过表达Li-7和Hep3B细胞中DEPDC1、CCL20和CCR6蛋白表达的影响；通过 CCK-8 实验检测 CCL20 和 CCR6 基因干扰对DEPDC1基因过表达Li-7和Hep3B细胞增殖的影响；通过克隆形成实验检测CCL20和CCR6基因干扰对DEPDC1基因过表达Li-7和Hep3B细胞克隆形成能力的影响；通过transwell实验检测CCL20和CCR6基因干扰对DEPDC1基因过表达Li-7和Hep3B细胞侵袭能力的影响。
（8）将Li-7和Hep3B分别分成三组：过表达对照+干扰对照组（pcDNA3.1+NC）、DEPDC1过表达+干扰对照（DEPDC1+NC）和DEPDC1过表达+CCL20干扰（DEPDC1+CCL20干扰），并制备条件培养基，然后通过管样形成实验检测上述三种条件培养基培养下的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）血管新生能力；通过transwell实验检测上述三种条件培养基培养下的HUVECs的侵袭能力。
（9）将Li-7和Hep3B分别转染pcDNA3.1和DEPDC1过表达载体，并制备条件培养基；HUVECs分别转染NC和CCR6 siRNA，然后两组细胞分别在上述两组条件培养基中培养，通过管样形成实验检测上述两种条件培养基培养下的HUVECs血管新生能力；通过transwell实验检测上述两种条件培养基培养下的HUVECs的侵袭能力。
结果：（1）DEPDC1基因在肝癌组织中的表达明显高于肝正常组织；DEPDC1蛋白在Huh-7和SNU-387细胞中的表达相对高于Li-7和Hep3B细胞；DEPDC1 siRNA可以明显下调Huh-7和SNU-387细胞中DEPDC1的mRNA和蛋白水平；与NC组相比，DEPDC1干扰组Huh-7和SNU-387细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力明显降低；与shNC组相比，DEPDC1 shRNA组Huh-7肿瘤体积明显受到抑制。
（2）与pcDNA3.1转染组相比，DEPDC1过表达载体转染组Li-7和Hep3B细胞DEPDC1的mRNA和蛋白水平明显提高；与pcDNA3.1转染组相比，DEPDC1过表达载体转染组Li-7和Hep3B细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力明显增强。
（3）基因表达谱芯片结果表明：与NC组相比，DEPDC1干扰组Huh-7细胞中有129个基因明显下调（下调倍数小于-2），并且有252个基因明显上调（上调倍数大于2）；GO分析结果表明，差异表达的基因明显富集于c-x-c趋化因子结合、血管系统发育、血管发育和细胞外基质；KEGG通路分析结果表明，差异表达的基因明显富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。
（4）与癌旁正常组织相比，DEPDC1、CCL20和CCR6 mRNA在肝癌组织中的表达明显上调，并且DEPDC1与CCL20、DEPDC1与CCR6以及CCL20与CCR6基因表达存在明显的相关性。
（5） western blot实验结果表明DEPDC1上调明显提高Li-7和Hep3B细胞中CCL20和CCR6蛋白的表达；CCL20和CCR6干扰能够明显回复DEPDC1上调对Li-7和Hep3B细胞中CCL20和CCR6蛋白表达的影响，并且CCL20干扰能够明显回复DEPDC1上调对Li-7和Hep3B细胞中CCL20和CCR6蛋白表达的影响；CCL20和CCR6干扰能够明显回复DEPDC1上调对Li-7和Hep3B细胞增殖、克隆形成和侵袭能力的增强作用。
（6）与pcDNA3.1+NC组相比，DEPDC1+NC组条件培养基培养的HUVECs细胞管样形成能力和侵袭能力明显增强，CCL20干扰则明显回复DEPDC1上调对HUVECs细胞管样形成能力和侵袭能力的增强作用。
（7）DEPDC1过表达组条件培养基培养的HUVECs细胞管样形成能力和侵袭能力明显增强， HUVECs 进行CCR6干扰则明显回复DEPDC1上调对HUVECs细胞管样形成能力和侵袭能力的增强作用。
结论：DEPDC1在肝癌中明显高表达，其上调促进HCC细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力，其下调抑制HCC细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力；同时，DEPDC1可上调CCL20和CCR6的表达，且DEPDC1与CCL20和CCR6表达均呈正相关；DEPDC1通过CCL20/CCR6通路调节HCC增殖、克隆形成、侵袭和血管新生能力。
含DEP结构域的蛋白质1 (DEP domain containing 1,DEPDC1)是一种高度保守的蛋白质，它位于1p31.3，主要表达于睾丸，但在人类其他正常组织中没有检测到表达。近年来，有报道表明DEPDC1在多种肿瘤中表达上调，并且在肿瘤发生和发展中发挥了重要作用。例如， DEPDC1 在膀胱癌发生过程中表达是上调的，通过小干扰 RNA （small-interfering RNA，siRNA)抑制其表达后可以显著抑制膀胱癌细胞的生长。在鼻咽癌组织中，DEPDC1的表达也明显上调，敲低DEPDC1的表达导致肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭受到明显抑制。综上所述，DEPDC1通常作为癌基因发挥作用。此外，有证据表明在HCC中DEPDC1的表达也明显上调，上调的DEPDC1表达与不良预后相关。据报道，通过肽段 11R-DEP破坏DEPDC1-ZNF224复合物可诱导HepG2细胞凋亡并抑制其增殖。此外，也有研究表明DEPDC1上调可诱导HCC细胞增殖和肿瘤转移能力。综上所述，DEPDC1在肝癌发生和发展中可能发挥着重要作用。然而，DEPDC1在HCC中的作用研究还不够全面，其下游调控机制尚不清楚。因此，本研究拟进一步探讨DEPDC1在HCC中的作用，并深入研究其下游机制。
方法：（1）通过Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT)数据库分析DEPDC1在肝癌组织和肝正常组织中的表达；通过western blot实验检测DEPDC1蛋白在四株HCC细胞（Li-7、Huh-7、SNU-387、Hep3B）中的表达，然后筛选合适的细胞株进行基因干扰。设计并合成 DEPDC1siRNA ，通过 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)和 western blot实验检测DEPDC1 siRNA的干扰效果。
（2）通过 CCK-8 实验检测 DEPDC1 基因干扰后对 Huh-7 和SNU-387细胞增殖的影响；通过克隆形成实验检测DEPDC1基因干扰后对Huh-7和SNU-387细胞克隆形成能力的影响；通过transwell实验检测干扰DEPDC1基因表达后对Huh-7和SNU-387细胞侵袭能力的影响。
（3）构建DEPDC1短发夹（DEPDC1 short hairpin RNA，DEPDC1 shRNA），转染Huh-7细胞，并筛选Huh-7细胞DEPDC1 shRNA干扰稳定细胞株，通过裸鼠成瘤实验观察DEPDC1基因干扰对肿瘤生长的影响。
（4）构建DEPDC1过表达质粒，转染Li-7和Hep3B细胞，通过RT-PCR和western blot实验检测DEPDC1过表达质粒转染细胞后表达效果；通过CCK-8实验检测DEPDC1基因表达上调后对Li-7和Hep3B细胞增殖的影响；通过克隆形成实验检测DEPDC1基因表达上调后对Li-7和Hep3B细胞克隆形成能力的影响；通过transwell实验检测上调DEPDC1基因表达后对Li-7和Hep3B细胞侵袭能力的影响。
（5）Huh-7细胞转染DEPDC1 siRNA和对照（Scrambled negative control，NC）后，通过人基因表达谱芯片检测DEPDC1在HCC进展中的可能调节机制，利用DAVID Bioinformatics Resources 6.7进行基因本体（gene ontology，GO）注释和信号通路富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)。
（6）通过RT-PCR实验检测收集的12例HCC组织及其对应的癌旁正常组织中 DEPDC1、CCL20 和 CCR6 mRNA 的表达，并分析DEPDC1与CCL20、DEPDC1与CCR6以及CCL20与CCR6表达的相关性。
（7）通过western blot实验检测DEPDC1过表达对Li-7和Hep3B细胞中CCL20和CCR6蛋白表达的影响；设计合成CCL20和CCR6干扰siRNA，通过western blot实验检测CCL20和CCR6基因干扰对DEPDC1过表达Li-7和Hep3B细胞中DEPDC1、CCL20和CCR6蛋白表达的影响；通过 CCK-8 实验检测 CCL20 和 CCR6 基因干扰对DEPDC1基因过表达Li-7和Hep3B细胞增殖的影响；通过克隆形成实验检测CCL20和CCR6基因干扰对DEPDC1基因过表达Li-7和Hep3B细胞克隆形成能力的影响；通过transwell实验检测CCL20和CCR6基因干扰对DEPDC1基因过表达Li-7和Hep3B细胞侵袭能力的影响。
（8）将Li-7和Hep3B分别分成三组：过表达对照+干扰对照组（pcDNA3.1+NC）、DEPDC1过表达+干扰对照（DEPDC1+NC）和DEPDC1过表达+CCL20干扰（DEPDC1+CCL20干扰），并制备条件培养基，然后通过管样形成实验检测上述三种条件培养基培养下的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）血管新生能力；通过transwell实验检测上述三种条件培养基培养下的HUVECs的侵袭能力。
（9）将Li-7和Hep3B分别转染pcDNA3.1和DEPDC1过表达载体，并制备条件培养基；HUVECs分别转染NC和CCR6 siRNA，然后两组细胞分别在上述两组条件培养基中培养，通过管样形成实验检测上述两种条件培养基培养下的HUVECs血管新生能力；通过transwell实验检测上述两种条件培养基培养下的HUVECs的侵袭能力。
结果：（1）DEPDC1基因在肝癌组织中的表达明显高于肝正常组织；DEPDC1蛋白在Huh-7和SNU-387细胞中的表达相对高于Li-7和Hep3B细胞；DEPDC1 siRNA可以明显下调Huh-7和SNU-387细胞中DEPDC1的mRNA和蛋白水平；与NC组相比，DEPDC1干扰组Huh-7和SNU-387细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力明显降低；与shNC组相比，DEPDC1 shRNA组Huh-7肿瘤体积明显受到抑制。
（2）与pcDNA3.1转染组相比，DEPDC1过表达载体转染组Li-7和Hep3B细胞DEPDC1的mRNA和蛋白水平明显提高；与pcDNA3.1转染组相比，DEPDC1过表达载体转染组Li-7和Hep3B细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力明显增强。
（3）基因表达谱芯片结果表明：与NC组相比，DEPDC1干扰组Huh-7细胞中有129个基因明显下调（下调倍数小于-2），并且有252个基因明显上调（上调倍数大于2）；GO分析结果表明，差异表达的基因明显富集于c-x-c趋化因子结合、血管系统发育、血管发育和细胞外基质；KEGG通路分析结果表明，差异表达的基因明显富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。
（4）与癌旁正常组织相比，DEPDC1、CCL20和CCR6 mRNA在肝癌组织中的表达明显上调，并且DEPDC1与CCL20、DEPDC1与CCR6以及CCL20与CCR6基因表达存在明显的相关性。
（5） western blot实验结果表明DEPDC1上调明显提高Li-7和Hep3B细胞中CCL20和CCR6蛋白的表达；CCL20和CCR6干扰能够明显回复DEPDC1上调对Li-7和Hep3B细胞中CCL20和CCR6蛋白表达的影响，并且CCL20干扰能够明显回复DEPDC1上调对Li-7和Hep3B细胞中CCL20和CCR6蛋白表达的影响；CCL20和CCR6干扰能够明显回复DEPDC1上调对Li-7和Hep3B细胞增殖、克隆形成和侵袭能力的增强作用。
（6）与pcDNA3.1+NC组相比，DEPDC1+NC组条件培养基培养的HUVECs细胞管样形成能力和侵袭能力明显增强，CCL20干扰则明显回复DEPDC1上调对HUVECs细胞管样形成能力和侵袭能力的增强作用。
（7）DEPDC1过表达组条件培养基培养的HUVECs细胞管样形成能力和侵袭能力明显增强， HUVECs 进行CCR6干扰则明显回复DEPDC1上调对HUVECs细胞管样形成能力和侵袭能力的增强作用。
结论：DEPDC1在肝癌中明显高表达，其上调促进HCC细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力，其下调抑制HCC细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力；同时，DEPDC1可上调CCL20和CCR6的表达，且DEPDC1与CCL20和CCR6表达均呈正相关；DEPDC1通过CCL20/CCR6通路调节HCC增殖、克隆形成、侵袭和血管新生能力。