暴发性肝衰竭是各种肝脏疾病的主要死因之一，对其治疗传统方法难以取得令人满意的疗效。原位肝移植被认为是终末期肝病的有效治疗手段，随着肝脏原位移植手术的广泛开展，它所面临的问题也越来越多的暴露出来，如供体短缺、价格昂贵、技术复杂等，使其临床应用受到诸多因素的限制。肝细胞移植是继原位肝移植后又一治疗各种肝功衰竭和遗传代谢性肝脏疾病的有效方法，具有简便易行、应用灵活、对受体影响小及价格相对低廉等特点，引起了广大学者的关注。大量实验及临床研究表明，肝细胞移植对各种肝功能衰竭的纠正有很好的效果，从而为肝衰竭的有效治疗提供一种极具发展前景的新方法。本研究应用肝细胞移植的相关技术，如肝细胞分离纯化、肝衰竭动物模型制备等，经门静脉、脾脏及腹腔三种途径行肝细胞移植，治疗大鼠急性肝衰竭。期望发现并证实肝细胞移植的最佳方式，为肝细胞移植技术的临床应用提供实验依据。 一、实验方法 1、急性肝衰竭模型的制备 将雄性成年SD大鼠60只随机分为5组，操作前12小时禁食，按1．2、1．4、1．6、1．8、2．0g/kg腹腔内注射10％D-氨基半乳糖(D-gal)溶液，观察并记录各组大鼠不同时段的临床表现、死亡数、肝脏生化指标及肝脏病理方面的变化，以确定制备大鼠急性肝功能衰 第囚军医大学项士学位论文 一 竭模型的最适剂量。 2、肝细胞分离纯化 雄性成年SD大鼠20只，采用胶原酶灌注法进 行肝细胞分离，所得肝细胞悬液按血细胞计数板作细胞计数，用0．4％胎盘 蓝染色判断细胞活率。 3、肝细胞移植 雄性成年 SD大鼠 164只，以 D唱al诱导制备急性肝 衰竭模型后，随机分为6组，即门静脉移植及对照组（I、11组），脾内移 植及对照组（Ill、IV组），腹腔移植及对照组（V、VI组）。l组30只，经 门静脉穿刺注射上述健康同系成年大鼠肝细胞悬液lin（约含ZX 10’个肝｝ 细胞入 同时肌肉注射环抱霉素圳＊s幻10mg／叱：11组26只，经门静脉 穿刺注射生理盐水lml，其余同1组。ill组30只，从脾尾向脾实质内注射 健康成年大鼠肝细胞悬液 IInl（约含 ZX 107个肝细胞入 同时肌肉注射 CsA10mg／kg；W组24只，脾内注射生理盐水IIYil，其余处理同皿组。V 组30 ．q，腹腔内移植肝细胞悬液Zml（约含4 X 10’个细胞＼VI组24只， 腹腔注射生理盐水2ml，作为V组的对照。 4、实验组和对照组大鼠肝功能检查及形态学研究 各组分别于肝细胞 移植后第1、3、5、7天，经腹主动脉抽血，用全自动生化分析仪测丙氨酸 氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBi）和 碱性磷酸酶（ALP）。同时取大鼠肝脏标本，用 10％甲醛固定，按常规方 法作HE染色。 二、结果 卜根据不同剂量组（l．2、l．4、l．6、l．8气 2．oghg）不同时间实验大鼠 的临床表现、死亡率、肝脏生化指标及肝脏病理方面的变化，选用 1．6g／kg D－gl，腹腔注射 60 ，J’时作为制备成年 SD大鼠急性肝衰竭模型的最适药物 剂量和最佳时间。 一3一 第曰早医大学硕士学位论文 一 2、采用胶原酶灌注法，20次分离所得肝细胞为 0．86～2．3 XIO’，平均 为 1．7X 108个。肝细胞活率为 87～95％，平均活率为 gi．3％。 3、I组与＊组比较，移植后0～24小时存活率分别为27％和23％， 移植 1周内存活率分别为 20％和 15％，经统计学比较两组在上述时段的存 活率无显著差异（PDeo乃5）。在肝细胞移植后1、3、5、7日，肝功能各项 指标（ALT、AST、ALP、TBi）两组比较也无显著差异（PIno．05）。肝脏 病理两组亦无明显差异。 4、Ill组与w组比较，移植后24小时的存活率分别为67％和25％，两f 组比较有显著性差异（P＜0．05）：1周内的存活率分别为叨％和门％，两 组比较也有明显差异（Pwto．05）。肝功能各项指标（ALT、AST、ALP、TBi） 在肝细胞移植后第 1 日，移植组与对照组无明显差异（P o 0刀5）；移植后 第3日，两组差异显著（P＜0．of）；至第5日，两组仍存在较大差异prt O．05）：7 日后，移植组与对照组无显著差异（P＞0刀5）。肝脏组织学在细 胞移植后第3天发生明显变化，移植组病理改变明显轻于对照组，植入脾 脏的肝细胞可短期存活。 5、V组与VI组比较，肝细胞移植后24小时两组大鼠存活率?