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促生长激素释放肽（Ghrelin）是1999年由Kojima等发现的含有28个氨基酸残基的多肽，是生长激素促分泌素(Growth hormone secretagogue, GHS)受体的内源性配体，具有刺激生长激素（Growth hormone, GH）分泌、促进撮食与肥胖等多种生物学活性。近年来研究表明，Ghrelin尚具有多种心血管保护作用，如可以增加心肌收缩力、舒张血管、延缓心梗后心衰的形成等，但其具体机制尚未完全阐明。本研究通过检测心衰患者和实验性心衰大鼠血清Ghrelin及血管紧张素II（Angiotension II,Ang II）水平变化，探讨Ghrelin对心功能的影响，并深入探讨Ghrelin是否可通过影响心肌细胞凋亡，进而影响心功能；进一步通过体外Ghrelin干预Ang II诱导的原代培养大鼠心肌细胞凋亡，探讨Ghrelin抑制Ang II诱导心肌细胞凋亡的作用及其机制。方法：1.随机选取慢性充血性心力衰竭（Chronic heart failure, CHF）患者及健康体检者，采集静脉血，检测血清Ghrelin及Ang II水平。2.通过结扎大鼠左冠状动脉前降支（Left anterior descending, LAD）构建心梗后心衰模型，分为假手术（Sham operation, SO）组、模型（Myocardial infarction, MI）组、模型-Ghrelin（MI-Ghrelin）组三组。通过观察大鼠一般情况；血流动力学指标：心率（Heart rate, HR）、左心室收缩末压（Left ventricular systolic pressure, LVSP）、左室舒张末压（Left ventricular end diastolic pressure, LVEDP）和左室内压最大上升/下降速度（Maximum ascending/declining rate of ventricular pressure,±dp/dtmax）；心脏大体形态、组织学改变；左心室重量指数及血清B型脑钠肽（B-type natriuretic peptide, BNP）水平判定心衰动物模型成功及Ghrelin对心功能的影响。成功构建心衰动物模型后检测以下指标：2.1ELISA法检测血清Ghrelin、Ang II水平；2.2TUNEL染色检测心肌组织细胞凋亡水平；2.3实时定量PCR、免疫组织化学染色检测心肌组织凋亡关键分子Caspase-3、促凋亡分子Bax及抗凋亡分子Bcl-2mRNA及蛋白表达水平；2.4实时定量PCR检测心肌组织内质网应激途径相关分子GRP78、Caspase-12和CHOP mRNA表达水平；2.5实时定量PCR、免疫组织化学染色检测心肌组织Ang II1型受体（AngiotensionⅡ type1receptor,AT1R）mRNA及蛋白表达水平；3.大鼠乳鼠心肌细胞体外原代培养，采用免疫细胞化学染色法鉴定心肌细胞，进一步应用Ang II诱导心肌细胞凋亡，利用Ghrelin干预（分为空白对照组、Ang II组、Ang II+Ghrelin组及Ghrelin组），检测以下指标分析Ghrelin干预Ang II诱导的心肌细胞凋亡作用及其机制：3.1MTT法检测细胞活性，DNA Ladder、末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）及碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）/钙磷脂结合蛋白Ⅴ（Annexin V, AV）双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡水平；3.2实时定量PCR、western blot及免疫细胞化学染色检测心肌细胞凋亡关键分子Caspase-3mRNA及蛋白表达水平；3.3实时定量PCR及免疫细胞化学染色检测心肌细胞促凋亡分子Bax及抗凋亡分子Bcl-2mRNA及蛋白表达水平；3.4实时定量PCR及western blot检测心肌细胞内质网应激途径相关分子GRP78、Caspase-12及CHOP表达水平；3.5实时定量PCR、western blot及免疫细胞化学染色检测Ang II1型受体(AT1R)表达水平，实时定量PCR检测Ang II2型受体（Angiotension Ⅱ type2receptor,AT2R）、Ghrelin1a型受体（Growth hormone secretagogue type1a receptor, GHS-R1a）及1b型受体（Growth hormone secretagogue type1b receptor, GHS-R1b）mRNA表达水平。结果：1.临床实验研究结果：心衰患者血清Ghrelin及Ang II水平明显高于健康者，Ghrelin水平与Ang II水平具有明显相关性。2.动物实验研究结果：2.1大鼠心衰模型构建成功：与假手术组相比，模型组大鼠LVEDP增高，LVSP和±dp/dtmax(mmHg/s)减低，左心室重量指数明显增加，大量纤维组织增生，血清心衰标记物BNP水平明显增高；与模型组比较，模型-Ghrelin组LVEDP减低，LVSP和±dp/dtmax(mmHg/s)增高，左心室重量指数降低，纤维组织增生减少，血浆BNP水平下降。提示：大鼠心衰模型构建成功，Ghrelin可改善心衰大鼠心功能。2.2模型组大鼠血清Ghrelin及Ang II水平均明显高于假手术组，同临床研究结果相一致。2.3模型组大鼠心肌组织细胞凋亡数目百分比明显高于假手术组，而模型-Ghrelin组心肌组织细胞凋亡数目百分比则明显低于模型组。提示：心衰时存在心肌细胞凋亡，Ghrelin可能通过抑制心肌细胞凋亡改善心功能。2.4Caspase-3为凋亡途径的关键分子，Bcl-2/Bax表达失衡与细胞凋亡密切相关。研究进一步检测心肌组织Caspase-3、Bcl-2及Bax表达，结果发现与假手术组相比，模型组Caspase-3mRNA及蛋白表达均明显增加，促凋亡分子Bax mRNA及蛋白表达均明显增加，抗凋亡分子Bcl-2mRNA及蛋白表达均明显减少；与模型组相比，模型-Ghrelin组Caspase-3mRNA及蛋白表达均明显减少，促凋亡分子Bax mRNA及蛋白表达均明显减少，抗凋亡分子Bcl-2mRNA及蛋白表达均明显增加。提示：心衰时存在心肌细胞凋亡，Ghrelin可能通过下调心肌组织Caspase-3表达，调节Bcl-2/Bax表达失衡，进而抑制心肌细胞凋亡改善心功能。2.5内质网应激途径为细胞凋亡重要途径之一，为进一步明确内质网应激途径是否参与心衰时心肌细胞凋亡，研究检测内质网应激相关分子表达发现与假手术组相比，模型组GRP78、Caspase-12和CHOP mRNA表达明显增加；与模型组相比，模型-Ghrelin组GRP78、Caspase-12和CHOP mRNA表达明显减少。提示：心衰时内质网应激反应参与心肌细胞凋亡，Ghrelin可抑制内质网应激反应。2.6Ang II为心衰时激活的重要神经内分泌因子之一，其通过Ang II受体发挥生物学作用。研究检测心肌组织AT1R表达水平，发现与假手术组相比，模型组AT1R mRNA及蛋白表达水平明显增加；与模型组相比，模型-Ghrelin组AT1R mRNA及蛋白的表达减少。提示：心衰心肌AT1R表达上调，高表达的Ang II可能通过上调的AT1R发挥生物学作用；而Ghrelin可能通过下调AT1R表达，进而抑制Ang II的作用。3.体外细胞实验研究结果：3.1MTT测心肌细胞活性发现与空白对照组相比，Ang II组心肌细胞存活率明显降低；与Ang II组相比，Ghrelin+Ang II组心肌细胞存活率明显增加。3.2DNA Ladder、TUNEL染色及PI/AV双染流式细胞仪检测心肌细胞凋亡水平，结果均发现与空白对照组相比，Ang II组心肌细胞凋亡率明显增加；与Ang II组相比，Ghrelin+Ang II组心肌细胞凋亡率明显下降。上述结果提示：Ang II可诱导心肌细胞凋亡，而Ghrelin可抑制Ang II诱导的心肌细胞凋亡。3.3进一步检测凋亡相关分子Caspase-3、Bcl-2及Bax表达，结果发现与空白对照组相比，Ang II组Caspase-3mRNA及蛋白表达均明显增加，促凋亡分子Bax mRNA及蛋白表达明显增加，而抗凋亡分子Bcl-2mRNA及蛋白表达明显减少；与Ang II组相比，Ghrelin+Ang II组心肌细胞Caspase-3mRNA及蛋白表达均明显下降，促凋亡分子Bax mRNA及蛋白表达明显减少，而抗凋亡分子Bcl-2mRNA及蛋白表达明显增加。提示：Ang II可通过上调促凋亡分子Caspase-3及Bax表达，下调抗凋亡分子Bcl-2表达诱导心肌细胞凋亡；Ghrelin可抑制Ang II诱导的心肌细胞凋亡。3.4为明确Ang II诱导的心肌细胞凋亡是否可由内质网应激途径介导，研究检测内质网应激相关分子GRP78、Caspase-12和CHOP表达。结果发现与空白对照组相比，Ang II组GRP78、Caspase-12和CHOP mRNA及蛋白表达亦明显增加；与Ang II组相比，Ghrelin+Ang II组GRP78、Caspase-12和CHOP mRNA及蛋白表达则明显减少。提示：Ang II可通过内质网应激途径诱导心肌细胞凋亡，而Ghrelin可抑制其作用。3.5研究进一步检测Ang II受体表达发现与空白对照组相比，单纯Ghrelin组AT1RmRNA及蛋白表达明显减少；Ang II组AT1R mRNA及蛋白表达明显增加，AT2R mRNA基因表达亦增加；与Ang II组相比，Ghrelin+Ang II组AT1R mRNA及蛋白表达明显减少，AT2R mRNA表达则无明显变化。上述结果提示：Ghrelin可通过下调AT1R表达，抑制Ang II诱导的心肌细胞凋亡。3.6GHS-R1a及GHS-R1b为Ghrelin受体，为明确GHS-R1a及GHS-R1b在Ghrelin抑制Ang II诱导的心肌细胞凋亡中的作用，检测GHS-R1a及GHS-R1b表达。结果发现与空白对照组相比，单纯Ghrelin组、Ang II组及Ghrelin+Ang II组GHS-R1a及GHS-R1b mRNA表达均明显增加；与Ang II组及Ghrelin组相比，Ghrelin+Ang II组GHS-R1a及GHS-R1b mRNA基因表达明显增加。上述结果提示：Ghrelin可能通过上调GHS-R1a及GHS-R1b表达，抑制Ang II诱导的心肌细胞凋亡。结论：1.临床及动物实验均表明心衰时Ghrelin及Ang II水平明显增高，Ghrelin水平与Ang II水平具有明显相关性。2．Ghrelin可以下调内质网应激相关分子GRP78、Caspase-12及CHOP表达，下调促凋亡相关分子Bax、Caspase-3表达，上调抗凋亡分子Bcl-2表达，抑制心肌细胞凋亡改善心功能。3. Ghrelin抗心衰的可能机制是上调心肌细胞Ghrelin受体(GHS-R1a、GHS-R1b)表达，下调AT1R表达，抑制Ang II诱导的心肌细胞凋亡。