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植物的光合作用为地球上几乎所有生物提供能量,是一切生命活动的能量源泉。在高等植物中,有一部分植物失去了光合作用的能力,进化成为形形色色的异养植物。失去光合作用的类群中,有一部分并未完全丢失光合作用能力,而是可以在需要时重新恢复光合作用,它们就成为一种光合作用退化的中间形态。光合作用功能的丢失是一个长期的过程,绿色植物比异养植物需要制造更多的营养物质,由此推断自养植物也应该拥有一个更为有效的光系统。目前有很多数据已经表明,作用于自养的绿色植物和异养植物的进化压力是不一样的。为了进一步验证这种假设,我们采用Illumina第二代测序仪结合常规PCR方法新测序了3种部分异养植物的叶绿体全基因组,(Pyrola decorata)喜冬草(Chimaphilajaponica)、大花菟丝子(Cuscuta reflexa)的测序完成分别达到93%、98%和100%。分别对三种植物的叶绿体基因组进行基因注释,以自养植物叶绿体编码的79个蛋白编码基因和4个rRNA基因为参照,结合基因库中其他6种异养植物和35种自养植物的基因组数据,对三种异养植物各自编码的蛋白编码基因做了进化速率的对比分析。结果表明,异养植物确实比自养植物积累了较多的同义核苷酸替代率和非同义核苷酸替代率,而非同义核苷酸替代率则更高。同义非同义核苷酸比率在一定程度上和植物的自养程度存在联系。研究的主要结论如下:
(1)本研究采用改良的高盐低pH法分离、纯化了五种异养植物叶绿体基因组DNA,并采用新一代Illmina测序平台进行测序。序列拼接得到大花菟丝子的完整叶绿体基因组,而另外两种杜鹃花科异养植物鹿蹄草和喜冬草的叶绿体基因组进行PCR补洞后也达到了93%以上的完整度,测序深度均在290×以上。另外两种完全异养植物毛花松下兰(Monotropa hypopitis)和杯茎蛇菰(Balanophora subcupularis)的拼接效果则较差。结果表明Illmina测序平台用于部分异养植物叶绿体基因组数据的获得具有一定的可行性,而对于完全异养植物则要依赖于更高纯度的叶绿体基因组DNA的获得。
(2)完整测序的大花菟丝子基因组大小为120,972 bp的叶绿体基因组全长,比Funk等测得的欧洲分布的大花菟丝子小了549 bp。整个基因组具有保守的四分体结构,由79,499 bp的长单拷贝区,8,369 bp的短单拷贝区,以及两个16,552bp的反向重复区将单拷贝区分开。经过序列比对后发现亚洲分布的大花菟丝子与欧洲分布的存在251个插入和210个缺失现象,最大的插入缺失长度分别为435 bp和426 bp。杜鹃花科的两种植物鹿蹄草和喜冬草的经过PCR扩增拼接后,获得了大约140 Kb的序列长度,鹿蹄草剩余的gap为13个,喜冬草为3个。
三种新测序的异养植物叶绿体基因组编码的基因为105个左右,包括全部的光系统基因、30个tRNA(大花菟丝子丢失trnK-uuu)和4个rRNA基因,其他叶绿体基因则有不同程度的缺失或未检测到。和自养植物相比,主要的缺失在于光呼吸相关的ndh基因及一些持家基因。通过与基因库中其他四种菟丝子属植物叶绿体基因组的序列比对发现,菟丝子属的叶绿体基因组非常保守,具有很好的同线性。杜鹃花科植物因为重复序列造成的基因排列顺序发生较大变化,同线性关系较为复杂。79个蛋白编码基因中,变异最大的分别是matK、rp120和cemA,而位于反向重复区的基因如4个rRNA基因和ndhB、rpsl2以及rps7的变异率则最低。遗传距离最远的分别是rp133、rp120、ycfl和matK,而大部分光合基因遗传距离都较近,说明分化较小。研究结果证明了反向重复区对于基因保守性的贡献,以及光合基因在部分异养植物中仍相对保守,具有不可替代的作用。
(3)核苷酸替代速率分析的结果证实了在异养植物中确实积累了高于其近缘自养植物的非同义(dN)和同义(dS)核苷酸替代速率。亚洲和欧洲分布的大花菟丝子具有不同的进化速率,亚洲分布的大花菟丝子核苷酸替代速率较慢。杜鹃花科植物随着其营养利用程度的增加,其所受的选择压力也缓解,推测自养的菌根共生植物有向异养植物发展的趋势。