补体系统(complement system)是将对病原体的识别有效地转化为宿主对最初感染发挥防御功能的主要机制之一。补体活化的三个主要结果是对病原体的调理作用、招募炎症细胞及形成膜攻击复合物(MAC)直接杀死病原体。然而,该系统的非正常激活会引起人体免疫系统的过度反应,造成正常组织的损伤,参与多种疾病的病理过程,临床上目前尚无理想的治疗药物。近年来,本课题组致力于中药补体抑制剂的研究,分离得到一些高效、低毒的小分子或均一的大分子多糖类天然补体抑制剂。鱼腥草为三白草科Saururaceae蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草或干燥地上部分,具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋的功效,临床上用于肺炎、上呼吸道感染、流感、肝炎等病的治疗具有明显疗效。在对中药抗补体活性成分的研究中发现,鱼腥草粗多糖具有强的抗补体活性,且无抗凝血副作用,并对内毒素(LPS)诱发的小鼠急性肺损伤(ALI)和发热症状都有明显的防治作用,是一种很有开发价值的天然补体抑制剂。故本课题以鱼腥草总多糖作为研究对象,以期发现总多糖中有价值的补体抑制活性成分并对其在补体激活过程中的作用机制进行初步探讨。本文对鱼腥草均一多糖各种衍生物的抗补体活性及作用靶点也进行了初步研究,以期找到活性增强的衍生物。主要研究结果如下：1.鱼腥草抗补体活性部位的确定考察了11批次鱼腥草商品药材的醇提物和水提物的体外抗补体活性。结果表明：各批样品的醇提部位和水提部分均显示不同程度的抗补体活性。选取四川产鱼腥草(水提液CH50:0.136±0.033mg/ml)作为研究对象,对其水提液进行醇沉,沉淀除去游离蛋白,透析除去小分子后得到总多糖部位(CH50:0.089±0.008mg/ml; AP50:0.405±0.023mg/ml)的抗补体活性最强,因此确定总多糖为鱼腥草抗补体活性部位之一。2.鱼腥草总多糖的制备工艺采用正交试验考察了总多糖的提取工艺参数并比较了水提、酸提、碱提、酶提四种不同的提取方法的提取效果；采用正交试验考察了醇沉工艺参数；比较了Sevage法、三氯醋酸法、盐酸法和木瓜蛋白酶法的对游离蛋白的清除效果；比较了大孔树脂D101吸附法、双氧水法和活性炭脱色法对鱼腥草总多糖中色素的脱色效果。确定总多糖制备工艺流程如下：药材粉碎,95%乙醇渗漉后晾干,加50倍的水,90℃煎煮3次,每次2h。提取液浓缩至相当于每毫升0.12g生药,加入4倍体积的90%乙醇,静置24h。离心去上清液,沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤,再以水复溶,减压回收,除去乙醇：复溶液加入三氯乙酸至20%(体积分数),于4℃下静置2h,10%NaOH调pH至7,离心,取上清。所得上清液用0.1mol/L的盐酸调pH至3.0,于50℃下,加入3%的活性炭吸附50min,离心,取上清液,浓缩,透析,冻干。本工艺简便、快速、稳定、得率高；本文首次将抗补体活性作为指标之一优化鱼腥草多糖的水提和醇沉工艺条件,以综合指标优选的工艺既保证了较高的多糖提取得率,又确保了所制备的鱼腥草多糖具有较强的抗补体活性,可以较好保证产品质量及疗效的稳定性。3.鱼腥草总多糖中内毒素的含量测定及清除本文使用显色基质鲎试剂,建立了针对多糖类成分中内毒素的(LPS)含量测定方法。测定了本课题组自制的鱼腥草总多糖的LPS含量为：58.09±1.67ng/mg,结果说明各总多糖中LPS含量较低(ng级)。采用柱色谱联用技术对鱼腥草总多糖中少量的LPS进行清除,疏水色谱与亲和吸附色谱联用得到了较好的清除效果：清除率分别为42.85%；鱼腥草总多糖清除LPS后的经典途径抗补体活性值分别为：0.080±0.014mg/ml,与原多糖相比,活性相当或略有提高。以上结果表明疏水色谱与亲和吸附色谱联用清除LPS的方法可行,并且不会减弱总多糖的抗补体活性。4.鱼腥草总多糖部位的抗补体活性成分以经典途径的抗补体活性为导向,从鱼腥草总多糖部位分离得到三个具有较强抗补体活性的多糖HC-PS1、HC-PS2和HC-PS3,经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)和高效毛细管电泳法(HPCE)确定三成分是均一的。采用NMR、 GC、GC-MS、IR和甲基化等方法确定HC-PS1、HC-PS2和HC-PS3的结构特征。HC-PS1为浅棕色疏松粉末；分子量为274530Da；比旋度[α]D25=-30.0(c0.3,H20)；蛋白含量为1.41%；糖醛酸含量为24.08%；糖含量为94.60%;不含硫酸基。完全酸水解得到糖组成主要有Rha:Ara:Man:Glc:GlcA:Gal:GalA=1.0:3.0:3.9：2.5：2.4：6.1：3.0,含有少量的Xyl。甲基化分析结合完全酸水解结果显示其主要连接方式有：末端、1,5-连接的阿拉伯糖等；1,3,6-连接和1,4,6-连接的甘露糖等；末端、1,4-连接、1,3-连接、1,3,6-连接、1,4,6-连接的葡萄糖等；有末端、1,4-连接和1,6-连接的半乳糖等；1,4-连接的半乳糖醛酸等；此外还含有少量末端连接的鼠李糖。其中以末端连接的阿拉伯糖,1,4,6-连接的甘露糖和末端、1,4-连接的半乳糖(或半乳糖醛酸)为主。HC-PS2为浅黄色疏松粉末；分子量为7928Da；比旋度[a]D25=-12.8(c0.3,H20)；蛋白含量为1.89%；糖醛酸含量为65.64%；糖含量为93.10%；不含硫酸基。完全酸水解得到糖组成主要有Man:Glc:GlcA:Gal:GalA=1.0:0.3:1.7:O.7:4.6,含有少量的Rha,Ara和Xyl。甲基化分析结合完全酸水解结果显示其主要连接方式有：末端连接的阿拉伯糖等；末端、1,6-连接和1,4,6-连接的甘露糖等；1,4-连接、1,3-连接和1,6-连接的葡萄糖等；1,4-连接的葡萄糖醛酸等；末端、1,4-连接、1,3,4-连接、1,4,6-连接、1,3,6-连接的半乳糖等;末端、1,4-连接、1,3,4-连接的半乳糖醛酸等；此外还含有少量末端连接的鼠李糖。其中以1,4-连接的葡萄糖(或葡萄糖醛酸)和末端、1,4-连接、1,3,4-连接的半乳糖(或半乳糖醛酸)为主。HC.PS3为浅黄色疏松粉末；分子量为216384Da；比旋度[α]D25=-62.8(c0.3,H20)；蛋白含量为1.53%；糖醛酸含量为20.19%；糖含量为93.73%；不含硫酸基。完全酸水解得到糖组成主要有Man:Glc:GlcA:Gal:GalA=1.0:0.5:0.4:1.2:0.4,含有少量的Rha,Ara和Xyl。甲基化分析结合完全酸水解结果显示其主要连接方式有：末端、1,5-连接的阿拉伯糖等；1,3’4-连接、1,4,6-连接和1,3,6-连接的甘露糖等；末端、1,4-连接、1,3-连接和1,4,6-连接的葡萄糖等；末端、1,4-连接、1,6-连接的半乳糖等；此外还含有少量末端连接的鼠李糖。其中以1,3,4-连接的甘露糖,1,4-连接的葡萄糖和1,4-连接的半乳糖为主。利用人血清作为补体来源评价三均一多糖的抗补体活性,结果显示HC-PS1、HC-PS2和HC-PS3不仅对豚鼠血清中的补体成分有抑制作用,同样可以拮抗人血清中的补体成分。HC-PS1、HC-PS2(?) HC-PS3对补体系统经典途径激活的半抑制浓度(CHso)分别为0.295±0.032mg/ml.0.183±0.017mg/ml和0.271±0.026mg/ml；HC-PS1、HC-PS2和HC-PS3对补体系统旁路途径激活的半抑制浓度(AP50)分别为01318±0.023mg/ml.0.219±0.018mg/ml和0.314±0.025mg/ml；阳性对照药物肝素钠的CHso和APso值分别为0.158±0.019mg/ml.0.205±0.02l mg/ml.自制了补体成分Clq、C2、C3、C4、C5、C9缺失的类补体缺失血清,进行了初步机制研究：考察了HC-PS1、HC-PS2口HC-PS3的在补体激活过程中的作用靶点。研究发现HC-PS1作用于补体成分C2、C4和C5:HC-PS2作用于补体成分C1q、C2、C4、C5和C9:HC-PS3作用于补体成分C2、C4和C5。肝素因具抗凝血作用而限制了其体内抗补体作用的发挥。本文采用凝血酶试剂考察了HC.PS1、HC-PS2和HC-PS3对凝血系统的影响,结果显示三者无抗凝血作用。HC.PS1、HC-PS2和HC-PS3抗补体活性与肝素相当,但对凝血系统无不良影响。用清除有机自由基DPPH法评价HC-PS1、HC-PS2和HC-PS3的抗氧化能力,IC50值分别为0.89mg/mL,0.95mg/mL,0.94mg/mL5.鱼腥草均一多糖衍生物的抗补体活性以三个鱼腥草均一多糖为底物,进行了硫酸化、羟乙基化和羧甲基化修饰,得到一系列多糖衍生化产物。硫酸化产物的IR光谱与原多糖相比,不仅位于3400cm-1左右的O-H键的伸缩振动峰变窄缩小,同时在818cm-1和1232cm-1出现了分别归属为C-S-O和S=O键的拉伸振动特征吸收；羟乙基化产物IR光谱与原多糖相比,位于3200～3600cm-1区域的O-H键的伸缩振动峰显著增强变宽,同时近2900cm-1处的C-H伸缩振动峰也大大增强,表明羟乙基已经取代在糖环的部分羟基上；羧甲基化衍生物IR图谱中显示了一个位于1736cm-1处羧基的特征吸收。HC-PS1的硫酸化、羟乙基化和羧甲基化的衍生物CH50值分别为0.128±0.024mg/ml、0.243±0.044mg/ml和0.241±0.038mg/ml；AP50值分别为0.084±0.012mg/ml、0.186±0.013mg/ml和0.085±0.006mg/ml. HC-PS2的硫酸化、羟乙基化和羧甲基化的衍生物CH50值分别为0.091±0.020mg/ml、0.248±0.034mg/ml和0.202±0.022mg/ml; AP50值分别为0.068±0.008mg/ml、0.118±0.011mg/ml和0.075±0.008mg/ml。HC-PS3的硫酸化、羟乙基化和羧甲基化的衍生物CH50值分别为0.137±0.029mg/ml、0.299±0.040mg/ml和0.260±0.014mg/ml;AP50值分别为0.080±0.007mg/ml、0.213±0.010mg/ml和0.073±0.002mg/ml。衍生物的补体作用靶点的研究表明：HC-PS1的硫酸化衍生物作用于补体成分C2、C3、C4、C5和C9组分；HC-PS1的羟乙基化衍生物作用于补体成分C2、C3、C4、C5和C9组分；HC-PS1的羧甲基化衍生物作用于补体成分C2、C3、C4、C5和C9组分。HC-PS2的硫酸化衍生物作用于补体成分C1q、C2、C3、C4、C5和C9所有检测组分；HC-PS2的羟乙基化衍生物作用于补体成分C2、C3、C4、C5和C9组分；HC-PS2的羧甲基化衍生物作用于补体成分C1q、C2、C3、C4、C5和C9所有检测组分。HC-PS3的硫酸化衍生物作用于补体成分C2、C3、C4、C5和C9组分；HC-PS3的羟乙基化衍生物作用子补体成分C2、C3、C4、C5和C9组分；HC-PS3的羧甲基化衍生物作用于补体成分C1q、C2、C3、C4、C5和C9所有检测组分。结果表明衍生化产物比原多糖的体外抗补体活性均有显著提高。鱼腥草均一多糖的各种衍生化产物的抗补体作用靶点也表现出多样性。