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研究目的:高血压诱导的机械牵拉作用是造成血管壁结构与功能改变即血管重构的重要因素之一。过去人们普遍认为临床上降压药物,主要是通过降低血压进而减少机械力对管壁作用而发挥治疗作用,这种作用强调了药物间接阻断机械力对血管的作用。降压药物是否可以直接阻断机械力对管壁的作用而改善血管重塑呢?未见相关报道。目前临床上常用抗高血压药物有四大类,分别为受体抑制剂、离子通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂和利尿剂等。本研究选取了临床传统上常用的利尿剂,氢氯噻嗪(Hydrochlorothiazide,HCTZ);离子通道阻滞剂,钙离子阻滞剂,硝苯地平(Nifedipine);受体抑制剂--血管紧张素受体A抑制剂,缬沙坦(Valsartan),以及血管紧张素转换酶抑制剂,依那普利(Enalapril)等四种药物作为实验药物,观察这些药物是否可以直接阻断机械力引起的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的作用。本课题组前期研究证实,机械牵张力(mechanical stretch stress,SS)可以非特异性激活小鼠VSMC细胞膜上所有跨膜蛋白如离子通道、受体和其它跨膜蛋白等,同时激活下游MAPK信号传导通路,改变基因转录和蛋白表达,最终导致细胞增殖和凋亡同时增加,从而加速血管重塑过程。本研究旨在上述研究模型和成果的基础上,继续探讨上述四种药物(氢氯噻嗪、硝苯地平、缬沙坦以及依那普利)是否可以直接阻断机械牵张力诱导的VSMC MAPKs活性、细胞增殖与凋亡以及细胞内DNA甲基化的影响,以期发现传统抗高血压药物新的作用机制(直接阻断机械力的作用),为传统的抗高血压药物的新降压机制的探讨提供重要的实验资料。实验方法:(1)利用实验室传统的贴块培养法,体外分离C57BL/6J小鼠的主动脉中膜,对VSMCs进行原代培养,通过倒置相差显微镜观察和拍照以及随后的进行形态学分析和鉴定,继而用免疫荧光的方法对VSMCs特有生物标志物平滑肌α肌动蛋白(SM-α-actin)进行鉴定,确认为高纯度的VSMCs后继续传代培养,扩增细胞,用于后续实验研究。(2)无血清细胞培养使得细胞同步化,处于静息状态下的VSMCs在分别给予氢氯噻嗪、硝苯地平、缬沙坦以及依那普利四药预处理1h后,给予机械牵张力牵拉不同时间和强度。收集处理后的细胞蛋白用免疫印迹法检测细胞内ERK1/2、JNK1/2和p38磷酸化水平。设DMSO的阴性对照组。(3)无血清细胞培养使得细胞同步化,处于静息状态下的VSMCs在分别给予氢氯噻嗪、硝苯地平、缬沙坦以及依那普利四药预处理1h后,给予10%机械牵张力牵拉强度1h,再静息培养23h。处理后的细胞用免疫荧光方法对细胞进行细胞增殖(Ki67)和细胞凋亡(TUNEL阳性)以及静息细胞(DAPI核染色)同时观察分析。设DMSO的阴性对照组。(4)无血清细胞培养使得细胞同步化,处于静息状态下的VSMCs在分别给予氢氯噻嗪及硝苯地平预处理1h,给予10%机械牵张力牵拉强度1h,再静息培养23h。处理后的细胞用免疫荧光方法对细胞进行DNA甲基化(5m C阳性)以及细胞核(DAPI染色)检测和分析。设DMSO的阴性对照组。结果:(1)组织块培养7天后,小鼠主动脉中膜组织有细胞从中长出,并逐渐达融合。而后,胰酶消化分离、传代培养。种植的VSMCs先呈圆形,贴壁后呈梭形,最后细胞长成“峰—谷”样特性。经免疫荧光鉴定VSMCs呈强阳性表达平滑肌特异性抗原SM-α-actin,阳性细胞数大于90%。(2)与加入DMSO的阴性对照组相比,氢氯噻嗪或硝苯地平对静息培养的VSMCs中ERK1/2、JNK1/2、p38的磷酸化无影响,但对机械力牵拉引起的MAPK磷酸化影响不同。机械力可激活MAPK三成员,硝苯地平可直接抑制机械力诱导的MAPK三成员的激活,与硝苯地平作用相反,氢氯噻嗪可进一步协同促进机械力诱导的MAPK的激活,而缬沙坦以及依那普利与硝苯地平作用相同。(3)同样,与加入DMSO的阴性对照组相比,氢氯噻嗪或硝苯地平对静息培养的VSMCs的增殖和凋亡无影响,但对机械力牵拉引起的细胞增殖和凋亡同时增加的影响不同。机械力可诱导细胞增殖和凋亡同时增加,硝苯地平可直接抑制机械力诱导的细胞增殖和凋亡同时增加,与硝苯地平作用相反,氢氯噻嗪可进一步协同促进机械力诱导的细胞增殖和凋亡同时增加。(4)DMSO的阴性对照组细胞甲基化水平较高,氢氯噻嗪对静息细胞甲基化水平无影响,与DMSO组相近,但硝苯地平可少量减少静息培养的VSMCs的甲基化。机械力牵拉引起的细胞甲基化明显减少,硝苯地平可抑制机械力诱导引起的甲基化减少,氢氯噻嗪也可阻断机械力诱导的甲基化减少达到与DMSO阴性组相近的高度。(5)与DMSO组相比,缬沙坦和依那普利并不引起静息细胞的MAPKs磷酸化变化,而机械力可诱导VSMCs ERK和P38MAPK磷酸化增加,这种增加可分别被缬沙坦和依那普利浓度依赖性抑制。结论:(1)机械力可诱导静息培养的VSMCs中ERK1/2、JNK1/2、p38的磷酸化增加,氢氯噻嗪起到协同促进作用,而硝苯地平与氢氯噻嗪作用相反,呈现抑制作用。缬沙坦以及依那普利与硝苯地平作用相同,呈现浓度依赖性抑制。(2)机械力可引起VSMCs增殖与凋亡同时增加,氢氯噻嗪起到协同促进作用,而硝苯地平与氢氯噻嗪作用相反,呈现抑制作用。(3)机械力可引起VSMCs甲基化减少,氢氯噻嗪可起到甲基化抑制作用,而硝苯地平的抑制作用要小于氢氯噻嗪的。总之,四大抗高血压药物对于机械力诱导的VSMCs内MAPKs、增殖和凋亡增加以及甲基化减少作用均有直接影响,但各自作用有所不同,该研究发现了临床上常用的抗高血压药物新的作用机制。