【摘 要】
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该研究的目的是利用巴斯德毕赤酵母表达系统,构建高效、可分泌表达甜蛋白Brazzein的毕赤酵母工程菌,从而可用人工的方法得到有甜味活性的BraZZein,解决Brazzein天然产量低、
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该研究的目的是利用巴斯德毕赤酵母表达系统,构建高效、可分泌表达甜蛋白Brazzein的毕赤酵母工程菌,从而可用人工的方法得到有甜味活性的BraZZein,解决Brazzein天然产量低、分离纯化困难两大问题.根据天然Brazzein氨基酸序列,用毕赤酵母偏爱密码子,人工设计并合成brazzein基因.考虑到克隆方便,在序列5端和3端分别引入BamHI和EcoRI位点,并在两个酶切位点的外侧分别加上保护碱基.为了保证brazzein基因按正确的阅读框架融合到毕赤酵母高效表达载体pPIC9K上的α-因子信号肽的切割位点之后,基因序列前重建XhoI位点和α-因子信号肽切割位点(Lys Arg)的编码序列.为了避免brazzein基因分泌表达载体构建过程中的部分酶切.该研究设计并构建了中间重组载体pUC19S.pUC19S的构建过程为:用pPIC9K上游的5AOX1 primer引物和下游TT终止子中的3AOX1 primer引物对载体pPIC9K进行PCR反应,获得pPIC9K上编码信号肽的基因序列(S);S/BamHI+EcoRI切出粘端,与同样双酶切处理的pUC19连接,得到重组载体pUC19S.用BamHI和EcoRI双酶切处理brazzein片段和pUC19S,经T4DNA连接酶,构建得到重组载体pUC19SB.pUC19SB/BamHI+EcoRI切下SB基因,与同样双酶切处理的pPIC9K连接,获得重组表达载体pPIC9KB.进一步的测序结果证明,brazzein基因已与α信号肽形成了正确的阅读框架.BglⅡ酶切重组质粒pPIC9KB,使之线性化,然后电击转化酵母受体菌毕赤酵母GS115(His<->,Mut<+>),转化物涂布RDB平板,利用组氨酸营养缺陷型法、甲醇利用型筛选His<+>,Mut<+>重组子.甲醇诱导培养,培养基上清SDS-PAGE电泳表明,brazzein基因已在毕赤酵母中分泌表达.摇瓶水平表达量可达0.15g/L,经硫酸铵沉淀、透析浓缩后品尝鉴定有浓郁的甜味活性.
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