本研究采用5-溴脱氧尿苷三磷酸(5-BrdUTP)掺入法，即在PCR反应体系中加入一定比例的5-溴脱氧尿苷三磷酸(5-BrdUTP)部分取代脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，对野油菜黄单胞菌α-淀粉酶基因(pHN8004)进行体外诱变。结果表明：5-BrdUTP浓度越高，诱变越强；浓度越低，诱变越弱。当5-BrdUTP浓度为dTTP的0.1％时，有利于筛选到高酶活的α-淀粉酶突变基因，过高的比例则产生过多的失活基因，比例太小又不足以形成一定的突变体库。用LBSP鉴别培养基进行筛选，经过3轮诱变和筛选，获得一编码α-淀粉酶且酶活力提高10倍的基因，将其克隆到pBluescriptKS(+)载体中，重组质粒命名为pHNh301。序列分析发现pHNh301有三个位点发生碱基突变，其中一个位于-35区，是A→G的转换。另外两个位于编码区，是G→A和C→T的转换，这两个碱基的突变造成两个氨基酸的改变，第一个是S263N(Ser→Asn)，在紧靠保守区3区下游。第二个是R380C(Arg→Cys)，在保守区4区下游。 将重组质粒pHNh301的α-淀粉酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A中，重组载体命名为pHBM905AM，将其用SalI酶切线性化后转化毕赤酵母GS115且实现了分泌表达。对重组酵母进行诱导，在培养温度28℃、甲醇流加量为1.0％(v/v)的情况下，第7d其分泌表达的α-淀粉酶的酶活最高，最高值为1081.30u.mL-1。该酶的最适反应pH值和最适温度与出发菌株相同，分别为pH5.9和30℃。