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新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的侵害禽类的急性高度接触性传染病,是家禽传染性疾病中危害最严重的疫病之一,由于对世界养禽业危害极大,故被国际兽疫局确定为A类传染病。使用疫苗进行免疫是全球养禽业防制该病的有效方法之一。由于传统疫苗(减毒活苗或灭活苗)潜在的不足,迫切需要提高和加强新城疫疫苗的有效性。DNA疫苗作为第3代疫苗,因其既有亚单位疫苗的安全性,又有减毒活疫苗的有效性而受到研究人员的瞩目。因此,研制新一代高效、安全,低副作用的ND DNA疫苗是近年来研究的热点之一。本研究将新城疫病毒标准强毒F48E9株F、HN基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS中,置于鸡β-肌动蛋白启动子的调控之下,构建成可用作DNA疫苗的NDV F和NDV HN基因表达质粒。经过酶切、测序分析筛选鉴定出含有F、HN基因的重组质粒,分别命名为pCAGGS-F和pCAGGS-HN。然后,将用质粒纯化试剂盒纯化后的质粒转染Hela细胞,用间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达情况。结果表明该表达载体可以表达F和HN基因。在国内首次应用构建的DNA疫苗对鸡胚进行免疫,以测试其安全性(孵化率为100%,6/6),为后期进行进一步试验奠定了基础。为了检测这些质粒是否可以诱导动物机体产生特异性免疫,将21日龄SPF鸡分作8组并且每只鸡带有翅标,分别肌注接种不同剂量和组合的重组质粒、载体质粒pCAGGS以及生理盐水。在免疫实验中,应用了外科手术中浸润麻醉的方式给雏鸡免疫。具体分组为,pCAGGS-F 100μg、pCAGGS-F 50μg、pCAGGS-HN 100μg、pCAGGS-HN 50μg、pCAGGS-F 50μg + pCAGGS-HN 50μg、pCAGGS-F 25μg + pCAGGS-HN 25μg、pCAGGS和生理盐水组,其中pCAGGS-F 25μg + pCAGGS-HN 25μg组免疫方式为胸肌单点(肌肉和皮下混合),一免28天后进行二免,二免后第四周,所有鸡都用0.2ml 103EID50的NDV F48E9株攻毒。免疫后及攻毒后每周无菌采集血清。结果pCAGGS-F 25μg + pCAGGS-HN 25μg免疫组的保护率达80%(4/5)。根据第一次所得数据,我们对pCAGGS-F 25μg + pCAGGS-HN 25μg组加大样本数目重新作免疫实验,结果攻毒保护率pCAGGS-F 25μg + pCAGGS-HN 25μg组达到60%(6/10)。表明我们构建的DNA疫苗能够诱导鸡体产生特异性免疫应答,并对同型NDV强毒攻击提供了一定的保护,并从鸡的解剖结构角度分析了免疫日龄和免疫部位的选择问题。