水稻是我国最重要的粮食作物之一，水稻育种是提高其产量和改善其品质的最有效方法之一。由于栽培稻的遗传基础日益狭隘，所以需要拓宽水稻抗性基因的来源，以促进抗性育种目标的实现。发掘和利用野生稻的有利基因是其中的策略之一。药用野生稻(Oryza officinalis Wall． CC)是原产我国的3种野生稻之一，其抗性基因是野生稻中最丰富的，受到水稻育种家的高度关注。但是药用野生稻与栽培水稻(AA)分属2个不同的种，两者存在明显的生殖隔离，通过杂交方法转移有利基因难度较大，限制了有利基因的高效转移。创建药用野生稻可转移大片段DNA文库(TAC库、BIBAC库等)，利用转基因技术将其大片段DNA直接转移到栽培稻中是利用有利基因的有效途径之一。本研究利用本校创建的药用野生稻TAC文库，以植物抗逆相关的转录因子保守序列作为探针，通过细菌原位杂交从药用野生稻TAC文库筛选与抗逆相关的克隆，然后利用农杆菌介导法，将药用野生稻中可能具有抗性基因的DNA片段转入栽培稻品种中，再通过分子鉴定、表型调查分析和逆境鉴定，获得可能有利用价值的转基因植株，供进一步研究使用。目的一是建立有效的筛选药用野生稻大片段DNA的方法，二是建立大片段DNA高效转化的技术，为进一步大量开展利用药用野生稻TAC文库并转移其有利基因提供基础。主要结果如下： ⑴与抗逆相关的候选克隆的筛选。选择与植物抗逆相关的AP2/EREBP、NAC、WRKY、bZIP等四个转录因子家族，根据它们基因家族的保守序列设计特异性引物，通过PCR扩增获得相应的保守序列作为探针，分别用同位素α-P32标记探针和地高辛标记探针对药用野生稻TAC库(20631个克隆)进行两次筛选，获得与抗逆相关的候选克隆。其中第一次用同位素α-P32标记探针筛选文库，共获得阳性克隆1752个；第二次选用地高辛标记探针，筛选第一次所获得的阳性克隆，获得阳性克隆171个。阳性克隆经PCR鉴定，能扩增出特定目的片段的克隆有114个，其中DREB63个，NAC11个，RF2a40个。对114个克隆进行酶切鉴定，证明其中45个有外源片段插入，插入片段的平均长度约为20kb。经PCR检测，其中有35个克隆可用于农杆菌转化。通过电击法，有10种克隆的质粒成功地转入农杆菌，分别为49R—O14，55R—A17，45R-P1，54R-P1，45R—N2，49R—H20，22D-P2,52D—M16，49N—A10，8R+D—A24。 ⑵水稻愈伤组织的诱导、选择及再分化。采用粳稻日本晴和籼稻华粳籼74的成熟胚(成熟种子)作为组织培养的外植体。其中籼稻诱导采用MS为基本培养基，粳稻诱导采用N6为基本培养基。两种材料均可诱导出愈伤组织并进行共转化，但是在分化阶段，日本晴出现绿点的百分率和苗分化率都明显高于华粳籼74。试验统计发现，同一转化农杆菌转化日本晴与华粳籼74时，前者的苗分化率较高；用不同转化农杆菌转化相同愈伤组织时，质粒所含外源片段越大愈伤组织的苗分化率越低。为了提高转化的筛选效率，在分化培养基中添加了50mg/L的潮霉素，生根培养基中添加了25mg/L的潮霉素。 ⑶转基因植株的获得和鉴定。利用质粒所转化的农杆菌对愈伤组织进行转化，结果共获4种转基因苗，分别为阳性克隆52D—M16、55R—A17、49R—O14和22D-P2的质粒所转化的农杆菌侵染日本晴愈伤得到的转化植株。利用蔗糖致死因子(SacB)特异性引物和潮霉素磷酸转移酶基因(Hpt)特异性引物，对转化植株基因组DNA进行PCR扩增，能扩增出Hpt和sacB基因片段；Southern杂交结果也证明外源片段已经整合入受体基因组；同时，抗性鉴定证明转化苗可以在潮霉素水溶液中正常生长，说明外源片段转入受体，且Hpt基因进行了表达。 ⑷转基因植株的表型变异及抗性鉴定。对部分随机克隆转化的转基因植株后代的主要农艺性状进行调查，发现转基因植株在穗颈长、穗颈粗、剑叶长、剑叶宽和穗长等方面都发生了不同程度的变异。以日本晴为受体的转基因植株后代穗颈大维管束数目明显高于受体，穗颈直径大于受体，而茎壁厚度比受体薄。一些转基因植株后代在柱头、稃尖、种皮颜色和粒形等性状上也发生了变异。值得一提的是，编号为WN37—4的转基因植株种子在萌发过程中不易被霉菌污染，这与药用野生稻相似。对一些转基因后代进行抗旱鉴定，发现以日本晴为受体的转基因植株的抗旱能力大都高于日本晴，其中编号为55O1—3—6—2和55O1—Q的转基因植株表现尤为突出；以华粳籼74为受体的转基因植株在抗旱方面无明显变化。抗冷能力鉴定结果表明，以日本晴为受体的转基因后代的苗期抗冷能力比日本晴低；以华粳籼74为受体的转基因后代抗冷能力得到明显提高，其中编号为WN36—1的综合抗冷能力较好。这些材料可能具有利用价值，值得进一步研究。