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研究目的:在前期的临床试验中本课题组已证实了升麻鳖甲汤加减方(modified Shengma Biejia Decoction,SMBJD)与化疗联合时,在老年急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者群体中可显著提高治疗有效率,改善患者的生活质量,本课题开展前的预实验中也证实SMBJD可以显著抑制AML细胞的增殖,但是其具体作用机制并不清楚。本实验拟研究SMBJD在体内外对AML细胞HL-60、NB-4以及K562增殖及凋亡的影响,并深入探讨其分子学机制,为中医药在AML治疗中的应用提供更多的科学依据。研究方法:体外实验研究方法1以不同终浓度的SMBJD(2、4、6、8、10 mg/ml)对HL-60、NB-4以及K562细胞进行干预,并以MTT实验在不同时间点(24、48、72 h)检测各组细胞的增殖活性变化,计算细胞增殖抑制率。2分别采用Annexin V/PI双染、JC-1染色细胞线粒体膜电位检测流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测以及Hoechst33258细胞凋亡形态学染色以观察SMBJD对HL-60、NB-4以及K562细胞凋亡形态学、凋亡发生率以及线粒体膜电位的影响。3 PI单染流式细胞术(FCM)检测用于观察SMBJD对HL-60、NB-4以及K562细胞细胞周期的影响。4分别以时间和浓度为变化因素,采用免疫印迹实验(Western Blot,WB)检测SMBJD对HL-60细胞凋亡以及MAPK通路中关键性调控蛋白表达的影响。5分别选用p38特异性抑制剂SB203580、JNK特异性抑制剂SP600125和ERK特异性抑制剂U0126阻断MAPK信号通路,以WB实验检测细胞凋亡相关蛋白表达的变化。体内实验研究方法1体外培养HL-60细胞将其用于采用建立荷瘤裸鼠模型,瘤体形成后分为对照组和SMBJD治疗组,治疗组每日以0.2 ml浓度为1.4 g/ml SMBJD灌胃,观察裸鼠皮下移植瘤的生长情况。2在荷瘤模型小鼠给药期间,隔日称量各组荷瘤裸鼠的体重,观察对比给前药后裸鼠体重以及生存状态等方面的变化。3 采用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色法观察SMBJD对裸鼠移植瘤内细胞凋亡产生的影响。4免疫组织化学实验(immunohistochemistry,IHC)检测裸鼠瘤体细胞中凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax的表达情况。研究结果:体外研究结果1 MTT实验的结果显示,在相同时间点,随着SMBJD药物浓度的递增(2、4、6、8、10 mg/ml),HL-60、NB-4以及K562细胞的增殖抑制比例均表现为上升性趋势,相较于对照组,差异存在显著性统计学意义(P<0.01);同一浓度的SMBJD分别作用于各组细胞细胞24 h、48 h、72 h,细胞的增殖抑制率随药物作用时间的延长而明显提高,故SMBJD对AML各细胞都有显著的增殖抑制作用,并且该作用呈现良好的浓度以及时间依赖性。2流式细胞术检测分别HL-60、NB-4以及K562细胞经不同浓度的SMBJD(4、6、8 mg/ml)作用后的凋亡率,结果显示:SMBJD可明显增加各组细胞中Annexin V(+)细胞的数量,诱导细胞发生凋亡,并且细胞凋亡率随药物浓度的增大而逐渐提高,体现出明显的浓度依赖性。3 HL-60、NB-4以及K562细胞分别经不同浓度的SMBJD(4、6、8 mg/ml)干预24 h后,以Heochest33258试剂盒染色后可明显观察到细胞的核逐渐出现固缩以及碎裂等细胞凋亡形态学表现,并且在与对照组的对比中,随着SMBJD药物浓度的增大,出现凋亡形态学变化的细胞数量逐渐增多,呈现较为显著的浓度-效应关系。4以不同浓度SMBJD(4、6、8 mg/ml)分别对HL-60、NB-4以及K562细胞进行为期24 h的干预后,以JC-1探针细胞膜电位检测试剂盒分别对各组、各系细胞进行染色,染色完成后在流式细胞仪卜进行检测,对检测的结果分析显示:SMBJD可降低各组细胞的线粒体膜电位水平,在与对照组的比较中,随着SMBJD浓度的逐渐增加,细胞线粒体膜电位下降的趋势也显著增强。5 HL-60、NB-4以及K562细胞分别经不同浓度的SMBJD(4、6、8 mg/ml)干预24 h后,以细胞周期检测试剂盒进行染色和流式细胞术检测,结果显示:SMBJD可造成HL-60、NB-4细胞阻滞于S期,K562细胞阻滞于G2/M期,与对照组比较时,随着SMBJD浓度的升高,各组细胞的阻滞周期内的细胞比例也相应增加,呈现出明显的浓度依赖性关系。6以不同浓度的SMBJD(4、6、8 mg/ml)对HL-60细胞进行干预,24 h后以Western blot实验进行检测,实验结果显示:凋亡行为执行的关键蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-caspase-3的表达随着SMBJD药物浓度的升高而逐渐提高,不仅如此,其上游凋亡行为启动的关键蛋白Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9以及相关促凋亡蛋白Bax的表达也随着SMBJD浓度的升高而上调,而抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达则随着SMBJD药物浓度的升高而降低。与此同时,MAPK信号通路相关蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38的表达也随着SMBJD浓度的递增而增加。7以中等有效浓度的SMBJD(6 mg/ml)对HL-60分别进行为期6 h、12 h、18 h、24 h的药物干预后,Western blot实验结果显示:凋亡执行关键蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-caspase-3的表达随着药物作用时间的增加而升高,凋亡启动关键蛋白Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9以及相关促凋亡蛋白Bax的表达也随着药物作用时间的延长而提高,而抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达则随着SMBJD作用时间的延长而下降。而MAPK信号通路相关蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38的表达也随着SMBJD作用时间的增加而提高。8在以中等有效浓度的SMBJD(6 mg/ml)对HL-60细胞进行干预前4h分别以18μM p38抑制剂SB203580、20 μM JNK抑制剂SP600125和20 μM ERK抑制剂U0126进行信号通路抑制的预处理,SMBJD干预24 h后Western blot实验结果显示:在对p38、JNK以及ERK信号进行分别抑制的情况下,与SMBJD药物干预组对比各抑制剂联合SMBJD干预组的凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9的表达均有所下降。体内研究结果1给药过程中隔日所测之裸鼠体重,绘制体重曲线图,统计结果显示SMBJD治疗组小鼠体重与对照组并不存在明显的差异(P>0.05)。给药周期结束后,裸鼠移植瘤实验结果显示,与对照组相比,SMBJD治疗组裸鼠皮下荷瘤体积有所减小,但统计学意义不显著(P>0.05)。2小鼠瘤体组织切片的TUNEL染色实验结果显示,在对照组中未发现明显的凋亡细胞,而SMBJD治疗组的小鼠瘤体组织切片中则出现了大量被TUNEL试剂标记的凋亡细胞。3免疫组织化学法(IHC)对两组小鼠瘤体组织切片进行检测,结果提示凋亡关键蛋白Cleaved-caspase-3以及促凋亡蛋白Bax表达增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少。研究结论:1 SMBJD在体外可显著有效地抑制HL-60、NB-4以及K562细胞的增殖,效应呈现浓度-时间相关性。2 SMBJD在体外可诱导HL-60、NB-4以及K562细胞发生凋亡,其过程可能涉及了内源性和外源性细胞凋亡途径的启动,MAPK信号通路可能作为上游调控信号参与了细胞凋亡的过程的调节。3 SMBJD在体外可对HL-60、NB-4以及K562细胞产生周期阻滞作用,但该作用并未显示出周期特异性。4 SMBJD对HL-60细胞荷瘤裸鼠的体重以及其他生存状态指标无明显影响。5 SMBJD对HL-60细胞荷瘤小鼠的瘤体生长具有一定的抑制作用,但与对照组相比并未体现出显著的统计学差异。6 SMBJD在体内抑制AML细胞增殖的机制可能涉及了细胞凋亡的诱导。