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目的:研究神经轴突导向因子Netrin-1对烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)感染的真菌性角膜炎发病机制的作用及对角膜上皮细胞增殖和迁移的影响。方法:1、烟曲霉菌感染C57BL/6小鼠角膜,建立小鼠真菌性角膜炎动物模型,用PCR法、Western blot法及免疫荧光法检测小鼠正常角膜和感染后1天、3天、5天角膜中Netrin-1 mRNA和蛋白的表达;用PCR法检测小鼠正常角膜和感染后1天、3天、5天角膜中Netrin-1受体A2BAR mRNA的表达。2、重组蛋白Netrin-1预处理后建立小鼠真菌性角膜炎动物模型,观察小鼠角膜感染后临床评分;用PCR法和Western blot法检测Netrin-1预处理前后感染角膜中IL-1β、TNF-α、IL-10 mRNA和蛋白的表达;采用免疫荧光法及MPO法检测Netrin-1预处理前后感染角膜中中性粒细胞的数量变化。3、烟曲霉菌刺激RAW264.7细胞,PCR法、Western blot法检测正常细胞及烟曲霉菌刺激后4小时、8小时、12小时细胞中Netrin-1 mRNA和蛋白的表达;PCR法检测正常细胞及烟曲霉菌刺激后2小时、4小时、6小时、8小时、10小时细胞中A2BAR的表达;重组蛋白Netrin-1预处理后烟曲霉菌刺激细胞,用PCR法检测正常细胞、Netrin-1预处理前后感染细胞中IL-1β、TNF-α、IL-10的表达。4、(1)建模前一天A2BAR拮抗剂(PSB1115)结膜下注射预处理小鼠角膜,感染后2天观察小鼠角膜炎症评分,用PCR检测烟曲霉菌感染组、Netrin-1+烟曲霉菌感染组、PSB1115预处理+Netrin-1+烟曲霉菌感染组的角膜中IL-1β、TNF-α和IL-10的表达。(2)PSB1115预处理RAW264.7细胞后烟曲霉菌刺激细胞,采用PCR法检测烟曲霉菌感染组、Netrin-1+烟曲霉菌感染组、PSB1115预处理+Netrin-1+烟曲霉菌感染组的细胞中IL-1β、TNF-α和IL-10的表达。5、用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测Netrin-1对HCECs增殖能力的影响;用细胞划痕实验检测Netrin-1对HCECs迁移能力的影响。结果:1、(1)PCR、Western blot结果显示,Netrin-1在正常小鼠角膜有表达,且较正常组相比,感染后1天Netrin-1表达降低,感染后3天表达升高至峰值,差异有统计学意义;免疫荧光染色显示,正常小鼠角膜中Netrin-1主要在角膜上皮细胞的细胞膜表达,感染后3天角膜上皮中表达升高。(2)PCR结果显示,A2BAR mRNA在正常小鼠角膜有表达,且感染后1天较正常组相比表达升高,感染后3天较正常组表达降低,差异有统计学意义。2、与PBS对照组相比,重组蛋白Netrin-1预处理小鼠角膜后,小鼠角膜炎症反应明显减弱,临床评分显著降低,中性粒细胞浸润减少,促炎因子IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白表达降低,抑炎因子IL-10 mRNA和蛋白表达升高,差异有统计学意义。3、烟曲霉菌刺激RAW 264.7细胞后4小时,Netrin-1 mRNA和蛋白表达明显低于正常细胞,刺激后8小时表达升高至峰值;A2BAR mRNA表达在刺激后2小时、4小时、6小时、8小时、10小时表达均明显高于正常RAW 264.7细胞,其中刺激后4小时表达最高,差异有统计学意义。与PBS对照组相比,重组蛋白Netrin-1预处理组IL-1β和TNF-α的mRNA表达明显下降,IL-10 mRNA的表达明显上升。4、在小鼠角膜及RAW264.7细胞中,PSB1115预处理+Netrin-1+烟曲霉菌感染组与Netrin-1+烟曲霉菌感染组相比,IL-1β和TNF-αmRNA表达升高,IL-10 mRNA表达降低,差异均有统计学意义。5、与正常组相比,重组蛋白Netrin-1显著促进HCECs的增殖和迁移。结论:在感染烟曲霉菌的C57BL/6小鼠角膜及RAW264.7细胞中,重组蛋白Netrin-1明显减轻炎症反应并且通过A2BAR受体发挥作用。此外,重组蛋白Netrin-1可以促进HCECs的增殖和迁移。