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硫链丝菌素(Thiostrepton,TSR)和吡咯吲哚霉素(Pyrroindomycin,PYR)是具有刚性骨架大环结构的微生物次级代谢产物,并具有抗菌、抗肿瘤、抗疟、免疫抑制等优良的生物活性。但是由于两者结构过于复杂,长期以来其生物合成途径中酶促大环化反应的生化机制和大环骨架的构效关系一直没有得到阐明。在本文的研究工作中,我们对于硫链丝菌素和吡咯吲哚霉素生物合成途径中刚性大环骨架构筑过程的酶学机制进行了研究,并基于对此过程中生化机制的认识对于抗生素的分子结构和生物合成途径进行了改造,同时利用这些结构改造后的衍生物作为化学探针研究了TSR发挥抗菌和抗癌活性的作用机制。 硫链丝菌素是一类核糖体翻译后修饰肽类天然产物,其核心骨架大环的构筑过程涉及到了硫肽类抗生素生物合成中的“共性化”翻译后修饰反应,即环化脱水/脱氢(形成氮杂五元环)、丝氨酸/苏氨酸脱水(形成脱水氨基酸),以及杂原子Diels-Alder(D-A)[4+2]环加成反应(核心骨架大环的大环化),然而其含有喹萘啶酸(Quinaldic acid,QA)结构单元的侧环形成过程在此前还尚未阐明。在本研究中,我们基于TSR生物合成途径中的“个性化”翻译后修饰反应,设计并开发了一套“前体导向的突变生物合成”策略,即使用合成的QA衍生物对于突变株△tsrT进行化学回补喂养。我们使用QA的衍生物作为“化学模块”,成功替代了TSR生物合成途径中四个基因模块的功能(即tsrT,A,E和D),并成功获得了TSR生物合成途径中的关键中间体、旁支产物以及衍生化的最终产物。通过对于这些化合物化学结构、反应活性以及生物活性的分析和测试,我们最终阐明了硫链丝菌素生物合成途径中侧环骨架的大环化过程以及构效关系,并发现了此类抗生素对于胞内寄生菌的双重抗菌活性和对于转录激活因子FOXM1过表达的肿瘤细胞系的双重抗癌活性。 螺环乙酰乙酸内酰胺吡咯吲哚霉素是一类由聚酮-非核糖体聚肽合酶(PKSNRPS)催化生成的杂合天然产物,其具有大环结构的刚性五环母核(Pentacycliccore)构筑过程中涉及到了两步连续的酶促分子内D-A反应。其中,PyrE3介导了第一步D-A反应,并催化线性底物生成脱氢萘烷的[6,6]并环结构;而PyrI4介导了第二步D-A反应,在催化底物生成螺环乙酰乙酸内酰胺结构的同时完成了PYR分子骨架的大环化。在本部分研究工作中,我们综合使用生物化学、微生物遗传学、结构生物学和计算化学等研究手段,系统性地阐释了螺环乙酰乙酸内酰胺(内酯)类抗生素生物合成途径中酶促D-A反应的生化机制,并将此类“底物过渡态构象折叠”酶的反应机制推广到更多的酶促协同反应实例中。在此基础上,我们还对于同样能催化脱氢萘烷结构形成的D-A酶Fsa2的生化特征进行了研究,并通过“基因组挖掘”的策略在一株全基因组测序的小单胞菌中寻找到了一个与PyrI4同源但是反应立体选择性截然不同的D-A酶PloI4。通过对于PloI4蛋白晶体结构和生化性质的研究,我们对于D-A酶的立体选择性控制机制给出了新的理解。 总之,在本论文的研究中,我们阐明了硫链丝菌素侧环和吡咯吲哚霉素刚性五环骨架生物合成过程中大环化反应的酶学机制,并基于对此的理解通过合成生物学策略实现了对两类抗生素的分子改造,最后我们使用这些改造的衍生物分子作为化学探针对于这些具有大环骨架结构的抗生素发挥独特生物活性的作用机制进行了研究。