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在哺乳动物体内，5-甲基胞嘧啶(5mC)被认为是唯一的DNA甲基化形式，可调控基因表达和多种生物学功能。5mC通过Fe(Ⅱ)和α-酮戊二酸(αKG)依赖的TET双加氧酶催化氧化，生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，并可进一步氧化形成5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。5mC及其氧化产物与TET蛋白共同调节多种生理功能，如核重新编程、胚胎发育、细胞分化、疾病的发生发展等。与哺乳动物不同，原核生物存在三种DNA甲基化形式，5mC、N4-甲基胞嘧啶(4mC)和N6-甲基腺嘌呤(6mA)。其中，6mA是主要的原核生物DNA甲基化形式。对一些细菌而言，6mA缺乏将导致其死亡。一些低等单细胞真核生物也存在6mA DNA修饰。令人惊奇的是:高等真核生物基因组中是否存在6mA修饰一直是一个悬而未决的科学难题。我们设想:1）过去所使用的分析技术和方法的检测灵敏度低，难以检测低丰度的6mA;2）6mA可能分布于特定组织或特定发育阶段而难以探知;3）由于快速去甲基化，6mA在体内高度动态变化而仅在短时间内出现。基于以上原因，人们难以确定高等真核生物中6mA的存在。 为了回答上述科学难题，我们通过与中科院动物所陈大华研究组合作，以经典的模式生物果蝇作为研究对象考察6mA的存在与可能的分布。在果蝇体内，5mC存在与否一直存在争议。我们设想，果蝇体内可能存在另外的DNA修饰，如6mA，并通过该修饰实现果蝇体内表观基因组调控。首先，我们发展了基于超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)的高灵敏分析方法，可检测16mA/108dA。利用该方法，我们发现6mA修饰在果蝇体内多个组织基因组中广泛存在。液相色谱联用高分辨飞行时间质谱(LC-QTof)分析，显示可能的果蝇6mA组分的精确分子质量为266.1250au，与6mA标准品标准分子质量(266.1248au)偏差仅为1.02ppm。另外，果蝇6mA组分分子峰碎裂模式和各个碎片(21碎片)准确质荷比，与标准6mA化合物均一致，进一步确定了6mA的存在。 利用UHPLC-MS/MS分析，发现果蝇在早期胚胎发育过程中6mA是高度动态变化的。0.75小时胚胎阶段，6mA修饰高达～0.07％(6mA/dA);4-16h胚胎阶段，6mA的含量约下降至0.001％(6mA/dA)。这些结果显示随着胚胎发育的进行，6mA含量出现急剧下降，说明在胚胎发育后期DNA6mA去甲基化机制可能发挥作用。活性分析显示后期胚胎细胞核提取液的确存在显著的DNA6mA去甲基化活性，预示果蝇存在DNA6mA的去甲基化酶。 哺乳动物体内TET蛋白家族在DNA去甲基化过程中发挥重要作用。基因比对显示，果蝇体内存在一种TET同原蛋白DMAD。DMAD在果蝇胚胎发育期的mRNA和蛋白质表达水平与6mA含量呈现反比关系。DMAD抗体处理的果蝇胚胎细胞核提取液DNA去甲基化活性显著降低，同时，敲低果蝇胚胎早期DMAD表达会导致胚胎后期6mA丰度明显提高。另外，敲除DMAD后，果蝇脑部和卵巢组织中6mA出现显著升高（增加10-70倍）。我们通过真核表达系统纯化了DMAD-CD和DMAD-CDmut蛋白，并建立DMAD的体外去甲基化反应体系。通过该体系，我们发现DMAD-CD在体外具有明显6mA去甲基化活性，并具有明显剂量与效应关系，但DMAD-CDmut并没有显示去甲基化活性。因此我们确定DMAD是果蝇体内主要的6mA去甲基化酶。 我们利用6mA特异性抗体对野生型和DMADdel果蝇基因组DNA进行免疫沉淀，然后进行高通量二代测序分析。结果显示，在DMADdel果蝇的卵巢中，6mA主要富集于转座子区域，表明在果蝇体内6mA修饰可能与转座子表达调控有关。 在开展模式生物果蝇研究之前，我们就已着手研究哺乳动物基因组中的6mA修饰。我们发现，在成年小鼠的脑、肺、肾、脾等组织基因组6mA修饰含量非常低，约5-256mA/108dA。通过与同济大学合作，我们进一步探讨小鼠生殖细胞和早期胚胎发育阶段基因组6mA修饰。结果表明，在小鼠卵母细胞内存在较高丰度6mA修饰(0.03％，6mA/dA)，是其它组织基因组的1200-6000倍。令人奇怪的是，精子中却没有检测到6mA修饰。体外培养受精卵，发现在胚胎二细胞时期6mA的丰度达到最高(0.18％，6mA/dA)。随着发育继续进行，6mA丰度出现急剧下降。至囊胚期时，6mA丰度为0.004％(6mA/dA)。免疫荧光成像分析表明，在小鼠生殖细胞和早期胚胎中，6mA主要分布于异染色质区域，暗示6mA在小鼠体内的存在可能与基因沉默有关。 与此同时，我们探讨了白藜芦醇对细胞DNA羟甲基化的影响。已有研究表明，长期摄入一定剂量白藜芦醇对多种疾病具有预防作用，例如高血压和癌症。DNA羟甲基化是否有所贡献尚不清楚。利用小鼠胚胎干细胞(mESc)，白藜芦醇暴露可显著提升细胞内的5hmC和5fC的含量，约为对照的1.8-2.1倍。利用发展的LC/MS/MS方法，分析细胞裂解液中α-酮戊二酸(αKG)和二羟基戊二酸(2HG)的含量。结果显示，白藜芦醇处理可显著提升细胞αKG水平，约为对照组的8倍，而2HG的含量没有显著变化。该结果说明白藜芦醇可能通过提高细胞内αKG含量来增强Tet蛋白的活性，从而使5hmC的含量增加。该过程表明白藜芦醇可能影响细胞内DNA羟甲基化和能量代谢过程。