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在哺乳动物体内,5-甲基胞嘧啶(5mC)被认为是唯一的DNA甲基化形式,可调控基因表达和多种生物学功能。5mC通过Fe(Ⅱ)和α-酮戊二酸(αKG)依赖的TET双加氧酶催化氧化,生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),并可进一步氧化形成5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。5mC及其氧化产物与TET蛋白共同调节多种生理功能,如核重新编程、胚胎发育、细胞分化、疾病的发生发展等。与哺乳动物不同,原核生物存在三种DNA甲基化形式,5mC、N4-甲基胞嘧啶(4mC)和N6-甲基腺嘌呤(6mA)。其中,6mA是主要的原核生物DNA甲基化形式。对一些细菌而言,6mA缺乏将导致其死亡。一些低等单细胞真核生物也存在6mA DNA修饰。令人惊奇的是:高等真核生物基因组中是否存在6mA修饰一直是一个悬而未决的科学难题。我们设想:1)过去所使用的分析技术和方法的检测灵敏度低,难以检测低丰度的6mA;2)6mA可能分布于特定组织或特定发育阶段而难以探知;3)由于快速去甲基化,6mA在体内高度动态变化而仅在短时间内出现。基于以上原因,人们难以确定高等真核生物中6mA的存在。 为了回答上述科学难题,我们通过与中科院动物所陈大华研究组合作,以经典的模式生物果蝇作为研究对象考察6mA的存在与可能的分布。在果蝇体内,5mC存在与否一直存在争议。我们设想,果蝇体内可能存在另外的DNA修饰,如6mA,并通过该修饰实现果蝇体内表观基因组调控。首先,我们发展了基于超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)的高灵敏分析方法,可检测16mA/108dA。利用该方法,我们发现6mA修饰在果蝇体内多个组织基因组中广泛存在。液相色谱联用高分辨飞行时间质谱(LC-QTof)分析,显示可能的果蝇6mA组分的精确分子质量为266.1250au,与6mA标准品标准分子质量(266.1248au)偏差仅为1.02ppm。另外,果蝇6mA组分分子峰碎裂模式和各个碎片(21碎片)准确质荷比,与标准6mA化合物均一致,进一步确定了6mA的存在。 利用UHPLC-MS/MS分析,发现果蝇在早期胚胎发育过程中6mA是高度动态变化的。0.75小时胚胎阶段,6mA修饰高达~0.07%(6mA/dA);4-16h胚胎阶段,6mA的含量约下降至0.001%(6mA/dA)。这些结果显示随着胚胎发育的进行,6mA含量出现急剧下降,说明在胚胎发育后期DNA6mA去甲基化机制可能发挥作用。活性分析显示后期胚胎细胞核提取液的确存在显著的DNA6mA去甲基化活性,预示果蝇存在DNA6mA的去甲基化酶。 哺乳动物体内TET蛋白家族在DNA去甲基化过程中发挥重要作用。基因比对显示,果蝇体内存在一种TET同原蛋白DMAD。DMAD在果蝇胚胎发育期的mRNA和蛋白质表达水平与6mA含量呈现反比关系。DMAD抗体处理的果蝇胚胎细胞核提取液DNA去甲基化活性显著降低,同时,敲低果蝇胚胎早期DMAD表达会导致胚胎后期6mA丰度明显提高。另外,敲除DMAD后,果蝇脑部和卵巢组织中6mA出现显著升高(增加10-70倍)。我们通过真核表达系统纯化了DMAD-CD和DMAD-CDmut蛋白,并建立DMAD的体外去甲基化反应体系。通过该体系,我们发现DMAD-CD在体外具有明显6mA去甲基化活性,并具有明显剂量与效应关系,但DMAD-CDmut并没有显示去甲基化活性。因此我们确定DMAD是果蝇体内主要的6mA去甲基化酶。 我们利用6mA特异性抗体对野生型和DMADdel果蝇基因组DNA进行免疫沉淀,然后进行高通量二代测序分析。结果显示,在DMADdel果蝇的卵巢中,6mA主要富集于转座子区域,表明在果蝇体内6mA修饰可能与转座子表达调控有关。 在开展模式生物果蝇研究之前,我们就已着手研究哺乳动物基因组中的6mA修饰。我们发现,在成年小鼠的脑、肺、肾、脾等组织基因组6mA修饰含量非常低,约5-256mA/108dA。通过与同济大学合作,我们进一步探讨小鼠生殖细胞和早期胚胎发育阶段基因组6mA修饰。结果表明,在小鼠卵母细胞内存在较高丰度6mA修饰(0.03%,6mA/dA),是其它组织基因组的1200-6000倍。令人奇怪的是,精子中却没有检测到6mA修饰。体外培养受精卵,发现在胚胎二细胞时期6mA的丰度达到最高(0.18%,6mA/dA)。随着发育继续进行,6mA丰度出现急剧下降。至囊胚期时,6mA丰度为0.004%(6mA/dA)。免疫荧光成像分析表明,在小鼠生殖细胞和早期胚胎中,6mA主要分布于异染色质区域,暗示6mA在小鼠体内的存在可能与基因沉默有关。 与此同时,我们探讨了白藜芦醇对细胞DNA羟甲基化的影响。已有研究表明,长期摄入一定剂量白藜芦醇对多种疾病具有预防作用,例如高血压和癌症。DNA羟甲基化是否有所贡献尚不清楚。利用小鼠胚胎干细胞(mESc),白藜芦醇暴露可显著提升细胞内的5hmC和5fC的含量,约为对照的1.8-2.1倍。利用发展的LC/MS/MS方法,分析细胞裂解液中α-酮戊二酸(αKG)和二羟基戊二酸(2HG)的含量。结果显示,白藜芦醇处理可显著提升细胞αKG水平,约为对照组的8倍,而2HG的含量没有显著变化。该结果说明白藜芦醇可能通过提高细胞内αKG含量来增强Tet蛋白的活性,从而使5hmC的含量增加。该过程表明白藜芦醇可能影响细胞内DNA羟甲基化和能量代谢过程。