论文部分内容阅读
目的:利用基因克隆技术,将具有特异性抗肿瘤血管生成活性的肿瘤抑素(Tumstatin)的活性部位T3与具有抗乳腺癌细胞增殖作用的催乳素受体拮抗剂G129R进行桥连,构建新型双重靶向性抗乳腺癌融合蛋白G129R-T3原核表达质粒pET22b(+)-G129R-T3,并在原核宿主细胞内进行诱导表达及鉴定。方法:首先根据人肿瘤抑素(Tumstatin)序列中编码69-88位氨基酸的碱基序列设计合成3条重叠互补的引物,利用重叠延伸PCR的方法分别扩增获得两端带有限制性内切酶BamHⅠ(NdeⅠ)和XhoⅠ识别序列的目的基因T3,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行分离纯化回收。再根据GeneBank中人催乳素(prolactin, PRL)的cDNA序列用primer 5.0软件设计合成2条特异性引物,以CHEN.WY赠与的pET22b(+)G129R-G129R为模板,分别扩增获得两端带有限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ(XhoⅠ)识别序列的目的基因G129R,并利用琼脂糖凝胶电泳对其进行分离纯化回收。然后,根据G129R的3’端与T3的5’端BamHⅠ识别序列可重叠的特点,以纯化产物G129R和T3混合作为模板,用G129R的上游引物和T3的下游引物,扩增得到两端带有限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ识别序列的融合基因G129R-T3,并利用琼脂糖凝胶电泳对其进行分离纯化回收。最后,将纯化回收的G129R-T3、G129R及T3片段分别克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α。选取阳性克隆,PCR鉴定,提取质粒,双酶切电泳鉴定后再次回收目的DNA片段,然后插入线性化pET22b(+)载体的NdeⅠ和XhoⅠ多克隆位点,构建3种原核表达质粒pET22b(+)-G129R-T3、pET22b(+)-G129R和pET22b(+)-T3。将其转化E.coli DH5α,经DNA序列测定正确后,利用RaCC、PrositeScan、ProtParam、TMHMM、HNN和SWISS-MODEL Workspace软件对上述序列进行生物信息学预测分析。然后将测序成功的这3种重组表达质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),利用IPTG诱导目的蛋白表达,然后进行菌体沉淀收集、包涵体溶解、IDA His·Bind预装柱平衡、细菌粗提物上样、非特异性蛋白洗涤和靶蛋白洗脱,最后通过SDS-PAGE和Western blot检测和鉴定融合蛋白表达。结果:凝胶电泳结果显示我们利用PCR扩增的方法获得预期大小的目的基因G129R-T3、G129R和T3,分别将这些目的片段纯化回收后,克隆入pMD18-T载体,经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切电泳鉴定。然后分别将双酶切回收的目的片段插入pET22b(+)的NdeⅠ和XhoⅠ多克隆位点,经菌落PCR鉴定和酶切电泳鉴定后测序,结果显示除2个同义突变外,DNA序列与GeneBank中记载的cDNA序列完全一致,符合率为99%。应用生物信息学方法分析并预测,G129R-T3(G129R)基因编码蛋白可能是一个非稳定的酸性蛋白,且该蛋白为非跨膜蛋白。将构建成功的重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3)后,优化诱导表达条件,SDS-PAGE分析结果显示目的蛋白主要以不溶性包涵体形式存在,定位于细胞质,与预期的分子量(约27kD和24kD)大小相吻合,且当IPTG终浓度为1.0mmo1/L,37℃诱导4h时目的蛋白表达量最大。Western blot分析表明,外源基因已经成功地在原核宿主细胞中表达。结论:成功构建了具有双重靶向性的融合基因G129R-T3的原核表达质粒pET22b(+)-G129R-T3,并可以在原核表达宿主E.coli BL21(DE3)中进行高效表达,为进一步研究其药理作用打下基础。