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猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus2,PCV2)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员,病毒粒子直径约17nm,无囊膜,二十面体对称,基因组由单股闭合环D状NA构成。PCV2被证明是近年来发生的断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的主要病原,并与仔猪先天性震颤、猪皮炎肾炎综合征、猪呼吸道综合征、母猪繁殖障碍等相关疾病有关。该病最早于1991年在加拿大被发现,其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、皮肤苍白及黄疸等,给世界养猪业造成了巨大的济经损失。为了对临床PCV2抗体进行检测及对PCV2进行流行病学调查。本研究利用昆虫杆状病毒系统表达的重组PCV2-Cap蛋白,经过Ni2+亲和层析柱纯化带有His-Tag标签的重组蛋白,用纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了一种间接ELISA诊断方法,用于临床PCV2感染猪或疫苗免疫猪血清抗体的检测。PCV2-Cap蛋白在昆虫细胞中的表达与免疫活性鉴定:利用业已构建的重组杆状病毒表达PCV2-Cap蛋白基因的种毒(rBac/PCV2-Cap),接种昆虫细胞株(Sf-21),对重组蛋白表达参数及纯化工艺进行了研究。PCV2-Cap蛋白表达量占总蛋白的18.7%左右。利用重组蛋白C末端设计的His-tag与Ni2+的螯合作用原理,采用Ni2+亲和层析柱纯化获得重组蛋白的纯度为90.1%,浓度为593μg/mL。SDS-PAGE与Western-blot分析证实,该重组蛋白可被PCV2特异性抗体所识别,具有良好的免疫活性,可作为ELISA检测的包被抗原。检测PCV2抗体的间接ELISA方法的建立:以纯化的重组PCV2-Cap蛋白作为包被抗原,建立了一种间接ELISA抗体检测方法。通过试验确定了最适反应条件,抗原最适包被浓度为2.965μg/mL,包被时间为37℃1h后4℃过夜,封闭液为1%BSA-PBST,作用时间为37℃1h,血清最适稀释度为1:100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释浓度为1:4000,作用时间为1h,最佳显色底物为ABTS,显色时间为37℃30min。判定标准为OD405nm≥0.343者判为抗体阳性,OD405nm≤0.281者判为抗体阴性,介于两者之间为可疑。用ELISA与IPMA两种方法对150份血清进行平行检测,符合率为95.3%(143/150);该方法的特异性为91.2%(31/34),敏感性为96.5%(112/116);与其他几种常见猪病毒参考血清无交叉反应。用该检测方法对PCV2人工感染猪血清检测结果,病毒接种后第5周抗体阳转,第8～9周抗体水平达到高峰。PCV2抗体检测试剂盒的组装及应用:在建立的ELISA方法的基础上,本研究对抗原反应板制备工艺,酶标二抗、阳性血清、阴性血清和试剂盒的保存条件进行了试验,组并装成ELISA抗体检测试剂盒。对试剂盒的批内、批间变异系数检测分别4.为0%～4.8%和8.9%～9.9%;试剂盒置-20℃保存12个月稳定。用该试剂盒对来自黑龙江、吉林、河北、上海等地猪场1085份血清抗体检测,阳性率为73.6%。本研究为临床PCV2抗体检测和进行PCV2流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法,试剂盒的研制为进一步商品化开发奠定了良好的基础。