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目的:
1.通过对比观察Wistar大鼠腹股沟皮下和附睾周围脂肪的间充质干细胞(ADMSC)的生物学特性,为组织工程种子细胞的优化选择提供基础研究依据。
2.分离培养Wistar大鼠睾丸支持细胞(SC)及初步鉴定。
3.观察大鼠ADMSC与SC在两种不同情况下(SC条件培养液和微囊化SC)共培养时,ADMSC生长发育的情况,探讨SC对ADMSC向男性性腺细胞方向分化可能存在的功能影响。
材料与方法:
1.Wistar大鼠,购于中国医学科学院实验动物研究所。
2.无菌条件下取4周龄Wistar大鼠腹股沟皮下和附睾周围脂肪,分离ADMSC差速贴壁后,于37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养。对比观察来源两个不同部位的ADMSC原代及传代培养细胞的形态,比较72h单位质量中两处细胞的获得数、贴壁率,运用四甲基偶氮唑蓝法检测两处细胞的生长曲线,应用流式细胞仪检测两处细胞的细胞周期以及表面标志CD44。地塞米松、胰岛素定向诱导ADMSC分化为脂肪细胞,油红O染色检测中性脂肪。
3.无菌条件下取13天龄Wistar大鼠睾丸,分离SC,于37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养。用油红O对其进行初步鉴定,用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测细胞卵泡刺激素受体(FSHR) mRNA的表达情况。并收集SC条件培养液。
4.将体外培养第二代(P2代)ADMSC与SC在两种不同情况下(SC条件培养液和微囊化SC)共培养。观察培养的ADMSC形态学变化,用Real-Time PCR检测在共培养的不同时期两组ADMSC中FSHR mRNA的表达情况。
结果:
1.单位质量腹股沟皮下和附睾周围脂肪组织中获得的间充质干细胞数量存在差异,单位质量的附睾周围脂肪中获取的细胞数多于腹股沟皮下脂肪垫中获取的细胞数(P<0.01)。两处细胞均为条索样,呈成纤维细胞形态;不同的时间点两处细胞的贴壁率相似,并且有同向变化的趋势;两处细胞的增殖能力相当;两处细胞绝大多数处于G0/G1,无明显差异;两处细胞表面标记CD44均为阳性;两处细胞经成脂诱导后,细胞质中有脂滴形成,经油红O染色,脂滴呈鲜红色。
2.大鼠SC胞体扁平,细胞核大而圆,核仁明显,细胞质内含有许多大小不等、分布不均的脂滴。经油红O染色,脂滴呈鲜红色小点。Real-Time PCR检测SC的FSHR mRNA呈阳性表达。
3.与SC条件培养液和微囊化SC共培养的第二代(P2代)ADMSC,在最初两天形态变化不明显,随时间延长细胞均逐渐由梭形变圆或多角形,且圆形或多角形细胞随着天数不断增加。Real-Time PCR检测两组ADMSC在共培养的不同时期FSHR mRNA均呈阴性表达。
结论:
1.自腹股沟脂肪垫和附睾周围游离脂肪提取的ADMSC仅在单位质量组织所获得干细胞数量上存在差异,即:单位质量的附睾周围脂肪中获取的脂肪干细胞数多于腹股沟皮下脂肪垫所获取的细胞数,但其生物学特性,如贴壁率、生长曲线、细胞周期和表面标志,以及成脂分化能力没有明显差异。
2.SC可在混合酶消化法下成功分离培养,且FSHR基因呈阳性表达。
3.ADMSC分别与微囊化SC和SC条件培养液共培养,细胞形态均有所改变,但是FSHR基因仍呈阴性表达。